*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Akútna lymfoblastová leukémia (ALL) je ochorenie, ktoré vzniká malígnou transformáciou kmeňovej hematopoetickej bunky lymfoidnej línie a následne dochádza ku klonálnej proliferácii lymfoidných prekurzorov so zastavením diferenciácie na rôznych stupňoch diferenciácie lymfoidných blastov( 1). Incidencia ochorenia má dva vrcholy, prvý je vo veku 4 až 5 rokov s incidenciou 5,3 na 100 000 obyvateľov a druhý vrchol sa nachádza okolo 50. roku života s incidenciou 2,3 na 100 000 obyvateľov za rok(2). Klasifikácia WHO delí ALL na B- a T-ALL podľa zasiahnutej bunkovej línie. Líniu B-ALL ďalej rozdeľuje na základe genetických zmien ako nešpecifikovanú alebo s rekurentnými genetickými abnormalitami (t(9;22)(q34.1;q11.2), t(v;11q23.3), t(12;21)(p13.2;q22.1), hyperdiploidia, hypodiploidia, t(5;14) (q31.1;q32.3), t(1;19)(q23;p13.3)(3). Stanovenie chromozómových aberácií má pri leukémii veľký význam pre prognózu a podanie správnej liečby. Typické chromozómové aberácie sa líšia v závislosti od veku pacienta a tiež bunkovej línie.

ALL je najčastejšia malignita detských pacientov a vyskytujú sa pri nej typické aberácie ako t(12;21), t(1;19) a hyperploidia, ktoré sú u dospelých s touto diagnózou pozorované len zriedka(4). Naopak, u dospelých ALL predstavuje len 20 % všetkých leukémií(5). Okolo 70 % dospelých s ALL má leukemické bunky s chromozómovými abnormalitami. Najčastejšiu aberáciu predstavuje t(9;22). Pri t(9;22) dochádza k zlomom a výmene častí dlhých ramien 9. a 22. chromozómu, čím vzniká fúzny gén BCR-ABL. Fúzny proteín produkovaný z tohto génu je aktívny onkoproteín s tyrozínkinázovou aktivitou, ktorý dáva leukemickým bunkám proliferačnú výhodu. Podľa konkrétneho miesta zlomu a procesovania mRNA môže vznikať hybridný proteín BCR-ABL s veľkosťou 210 kDa (p210), 190 kDa (p190) a 230kDa (p230). Pacienti s B-ALL majú prítomný p190 (skôr u detí) alebo p210 (častejšie u dospelých). Klinické znaky u pacientov s B-ALL p190 a p210 boli veľmi podobné, mierne horší klinický výsledok bol pozorovaný u pacientov s p210(6). Translokácia t(9;22) existuje v dvoch formách – v jednoduchej a variantnej. V jednoduchej sa na nej zúčastňujú len dva chromozómy 9 a 22, a variantná zahŕňa okrem spomínaných chromozómov aj ďalší. Tyrozínkinázové inhibítory ako liečivá vhodné pri klasickej t(9;22) sú účinné aj pre variantné formy(7,8).

Pri akútnych leukémiách je často zaznamenaná nadexpresia génu WT1. Gén WT1 sa nachádza na krátkom ramene 11. chromozómu v oblasti 11p13. Ako transkripčný faktor má dôležitú úlohu pri kontrole proliferácie, diferenciácie a pri apoptóze. Stupeň jeho expresie je obzvlášť významný pri hematopoéze, keď je gén exprimovaný v nezrelých bunkách, a až po jeho poklese môže dôjsť k maturácii krvných elementov(9,10). Samotný gén WT1 predstavuje nešpecifický marker, keďže sa nespája len s jedným typom leukémie, avšak slúži ako terapeutický cieľ a znak na monitorovanie minimálnej reziduálnej choroby(9). Prognóza ALL sa odvíja od viacerých faktorov a zhoršuje sa s opakovanými atakmi leukémie na jedinca. Šancu na kompletnú remisiu znižuje vek pacienta, znížená tolerancia liečby a vyšší počet leukocytov.

Kazuistika

Muža vo veku 63 rokov v počiatku anamnézy v dôsledku epidermoidného karcinómu pravej podnebnej mandle sledoval jeho spádový onkológ. Pacient podstúpil chemoterapiu a rádioterapiu, čo pravdepodobne následne vyvolalo myeloproliferatívnu neopláziu (MPN) s neprítomným filadelfským chromozómom (Ph). Od roku 2009 je vedený v hematologickej ambulancii s diagnózou esenciálna trombocytémia. V roku 2014 mu bola diagnostikovaná sekundárna myelofibróza.  O 3 roky, v roku 2017, bol u pacienta zaznamenaný prechod do B-bunkovej ALL. Na základe prítomnosti 21 % patologickej populácie B-lymfoblastov a na základe imunofenotypu (prítomné znaky CD10, CD19, TdT a neprítomný CD117) bola u pacienta potvrdená B-ALL. Vzorky kostnej drene (KD) a periférnej krvi (PK) sme v našom laboratóriu prvýkrát vyšetrili v októbri 2017. Na základe genetickej analýzy boli zaznamenané patologické nálezy spojené s nepriaznivou prognózou. Leukémia u pacienta progredovala, na čo bola podaná silná liečba, ktorá viedla k hemotoxickému šoku a bol zaznamenaný zhoršený hematokryt.

Na obrázku 1 je znázornený vývoj liečby u pacienta. Prognóza je momentálne priaznivá, pretože pacient sa nachádza v stave remisie bez blastov.

Metódy

Cytogenetická analýza bola uskutočnená na vzorkách kostnej drene, spracovaných podľa štandardných cytogenetických postupov po 24-hodinovej kultivácii. Preparáty boli farbené Wrightovým roztokom. Následne bolo hodnotených 20 metafáz vo svetelnom mikroskope, ak to kvalita vzorky umožnila, a karyotyp bol zapísaný podľa International system for human cytogenetic nomenclature (ISCN)(12). Fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) sa uskutočnila na vzorkách KD alebo PK spracovaných podľa štandardných postupov. Na detekciu aberácií na chromozómoch 2, 7, 9 a 22 boli použité špecifické lokusové sondy a celochromozómové sondy (WCPs). Prehľad sond je opísaný v tabuľke 1. Vo fluorescenčnom mikroskope bolo hodnotených 200 jadier. Molekulová analýza bola uskutočnená pomocou metódy RT-PCR. Na detekciu génov WT1 a BCR-ABL bol použitý kitQiagen (Dynex).

Výsledky

Vzorka pacienta bola vyšetrovaná v našom laboratóriu doposiaľ štyrikrát. Prvé vyšetrenie KD a PK sa uskutočnilo v októbri roku 2017 po prechode do ALL. Prehľad vyšetrení a ich výsledkov sa nachádza v tabuľke 2.

Cytogenetické a FISH vyšetrenie

Cytogenetickou analýzou sme pri prvom vyšetrení odhalili variantnú formu translokácie t(9;22) chromozómu, keď okrem chromozómov 9, 22 je do translokácie zahrnutý aj tretí – chromozóm 2. Došlo k inzercii časti krátkych ramien chromozómu 2 do chromozómu 9 v oblasti 9q34. Stanovili sme karyotyp 46, XY, der(9)t(9;22)(q34;q11)ins(9;2) (q34;p15p23) (obrázok 2). Chromozómové aberácie pozorované na karyotype (obrázok 2) sme potvrdili FISH metódou. V 97 % jadier bola prítomná BCR-ABL fúzia (obrázok 3). Pomocou celochromozómových sond WCP 2 a WCP 9 sme odhalili inzerciu krátkych ramien chromozómu 2 do dlhých ramien chromozómu 9 (obrázok 4). Pri kontrolnom vyšetrení po 6 mesiacoch sa napriek liečbe v patologickom klone okrem predchádzajúcich zmien objavila aj sekundárna aberácia v podobe dic(7;9). Pacient nemal ani jeden zdravý 9. chromozóm.

Karyotyp pacienta (obrázok 5) sme určili ako 45, XY, dic(7;9)(p11;p11), der(9)t(9;22) (q34;q11)ins(9;2)(q34;p15p23). FISH vyšetrenie potvrdilo dic(7;9) pomocou špecifických lokusových sond c7/7q22/7q36 a 9c/9p16 (obrázok 6). Centroméry chromozómu 7 (obrázok 7a) a 9 boli obe prítomné, na základe čoho sme potvrdili dicentrický chromozóm. Špecifickou lokusovou sondou sme zároveň detegovali deléciu krátkeho ramena chromozómu 9 v oblasti p16 (obrázok 7 b), čo nám nepriamo potvrdzuje prítomnosť dicentra zloženého z dlhých ramien chromozómov 7 a 9 a zároveň nám umožňuje uskutočňovať ďalšie vyšetrenia na interfázových jadrách a sledovať monozómiu 9p. Nasledujúca kontrola (6/2018) sa uskutočnila z periférnej krvi pomocou FISH analýzy. Bola odhalená prítomnosť 2 klonov translokácie 9;22 – klasický – postihujúci len dva chromozómy, 9 a 22, a klon s variatnou translokáciou der(9) t(9;22)(q34;q11)ins(9;2) (rovnakou ako pri prvom náleze). Posledná kontrola (8/2018) sa uskutočnila zo vzorky kostnej drene. Cytogenetická analýza nebola možná pre neúspešnú kultiváciu a FISH analýza potvrdila negatívny výsledok na prítomnosť t(9;22).

Molekulová analýza

Molekulovou analýzou bol u pacienta detegovaný fúzny transkript BCR-ABL p210 pri všetkých vyšetreniach. Hladina jeho expresie sa v danom čase menila a najvyššia hodnota bola zaznamenaná pri druhej kontrole (4/2018), následne už prítomnosť fúzneho transkriptu rapídne klesala (graf 1). Fúzny gén možno kvantifikovať pomocou NCN, čo predstavuje pomer počtu kópií fúzneho génu k počtu kópií kontrolného génu (tabuľka 2).  Pacientovi bol analyzovaný stav expresie génu WT1. Fyziologická hodnota zo vzorky kostnej drene je 0,01 – 0,04, v periférnej krvi je to 0,002. Nadexpresia génu WT1 bola pozitívna pri prvých dvoch vyšetreniach a podobne ako pri ostatných výsledkoch bolo možné pozorovať zhoršenie stavu pacienta práve pri druhom, keď hladina expresie v kostnej dreni stúpla z 0,057 na 0,09. Následne pacient začal reagovať na liečbu a jeho stav sa zlepšil.

Diskusia

Pacientovi bola stanovená diagnóza B-ALL. Pre B-ALL je typická prítomnosť znakov CD10, CD19 a TdT a zároveň neprítomnosť CD117(11), čo koreluje s našimi výsledkami, u pacienta boli totiž imunologickou fenotypizáciou prítomné znaky CD10 (92 %), CD19 (100 %) a TdT (93 %). Najčastejšou chromozómovou aberáciou pri ochorení B-ALL u dospelých je t(9;22). Táto aberácia, či už klasická, alebo variantná, je pri B-ALL spojená so zlou prognózou. Názory na biologickú funkciu klasickej a variantnej formy sa rôznia. Isté štúdie naznačujú, že pacienti s variantnou formou majú horšie výsledky, avšak existujú aj protichodné názory, podľa ktorých takéto translokácie nemajú vplyv na výsledok liečby a prežívanie(13,14). Na základe analýzy genetických výsledkov sa možno domnievať, že pacient mal pôvodne klasickú t(9;22), ktorá bola detegovaná pri pozitívnej reakcii pacienta na liečbu, keď došlo k poklesu buniek s patologickým klonom z 97 % a 20 %. Pri druhom kontrolnom vyšetrení (4/2018) pribudol k pôvodnému nálezu dic(7;9). V patologickom klone sa u pacienta nenachádzal ani jeden 9. chromozóm, ktorý by nebol poznačený chromozómovou prestavbou. Krátke ramená 7p a 9p obsahujú tumorózne supresorové gény a podľa hypotézy ich strata vedie k leukemogenéze. Samotná prítomnosť dic(7;9) pri diagnóze B-ALL ovplyvňuje prognózu, pričom závisí najmä od veku pacienta. Detský pacient má podľa literatúry priaznivú prognózu a dospelý, naopak, nepriaznivú. Pri dospelých pacientoch sa za najúspešnejšiu liečbu považuje transplantácia kostnej drene, ak to celkový zdravotný stav pacienta dovoľuje(15,16,17).

Okolo 70 % dospelých pacientov s ALL a t(9;22) má aj sekundárne chromozómové aberácie. Najčastejšie ide o +der(22)t(9;22), +21, abnormality 9p, vysokú hyperploidiu (viac ako 50 chromozómov), +8, –7, +X, zmeny na 8. chromozóme, nadbytok časti 1q alebo stratu 7p. Prognóza sa líši v závislosti od konkrétnej sekundárnej aberácie(14). V štúdii Pan a kol. (2006) mali 4 zo 7 pacientov súčasne obe spomenuté chromozómové aberácie. Traja pacienti boli liečení chemoterapiou a jeden podstúpil transplantáciu kostnej drene, dĺžka ich prežitia bola od 8 do 14,5 mesiaca(17). Zlepšenie stavu nášho pacienta napriek zlej prognóze si odôvodňujeme vhodnou liečbou, ktorá bola pacientovi podaná v správnom čase. Dôležité je naďalej sledovať pacienta a v skorom štádiu podchytiť relaps.

Záver

Komplexná prestavba chromozómov bola pozorovaná u 63-ročného pacienta, ktorý prekonal prechod Ph negatívnej MPN na Ph pozitívnu B-bunkovú ALL. Pacient podstúpil chemoterapiu, na ktorú zareagoval hemotoxickým šokom, preto mu musela byť znížená dávka liečiv. Po následnom stabilizovaní krvného obrazu sa stav pacienta zlepšil a momentálne je v stave remisie. Pre predchádzajúci cytogenetický nález s nepriaznivou prognózou je pre nás tento prípad zaujímavý a napriek stavu remisie je naďalej nutné pacienta pravidelne monitorovať.

Poďakovanie: Rada by som sa touto cestou poďakovala všetkým kolegom, ktorí spolupracovali na vyšetrení pacienta, a MUDr. Hatalovej za osobnú konzultáciu.

 LITERATÚRA

1. http://www.hematology.sk/docs/ALL_2017.pdf
2. Sant M, Allemani C, Tereanu C et al. Incidence of hematologic malignancies in Europe by morphologic subtype: results of the HAEMACARE project. Blood 2010; 116: 3724–3734.
3. http://www.cancer.ca/en/cancer-information/cancer-type/leukemia- acute-lymphocytic-all/acute-lymphocytic-leukemia/classification- of-acute-lymphocytic-leukemia/?region=on
4. Kolenová A, Kaiserová E. Akútne leukémie v detskom veku. Pediatr. Prax 2012; 13(4): 161-165.
5. Terwilliger T, Abdul-Hay M. Acute lymphoblastic leukemia: a comprehensive review and 2017 update. Blood Cancer Journal 2017; 7: e577.
6. Gleissner B, Gokbuget N, Bartram CR, et al. Leading prognostic relevance of the BCR-ABL translocation in adult acute B-lineage lymphoblastic leukemia: a prospective study of the German Multicenter Trial Group and confirmed polymerase chain reaction analysis. Blood 2002; 99(5): 1536-43.
7. Piccaluga PP, Paolini S, Martinelli G. Tyrosinekinase inhibitors for the treatment of Philadelphia chromosome‐positive adult acute lymphoblastic leukemia. Cancer 2007; 110(6): 1178-1186.
8. Sawalha Y, Advani AS. Management of older adults with acute lymphoblastic leukemia: challenges and current approaches. International Journal of Hematologic Oncology 2018; 7(1).
9. Busse A, Gokbuget N, Siehl JM, et al. Wilms’ tumor gene 1 (WT1) expression in subtypes of acute lymphoblastic leukemia (ALL) of adults and impact on clinical outcome. Ann Hematol 2009; 88: 1199-1205.
10. Ellisen LW, Carlesso N, Cheng T, et al. The Wilms tumor suppressor WT1 directs stage-specific quiescence and differentiation of human hematopoietic progenitor cells. EMBO Journal 2001; 20(8): 1897-1909.
11. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. WHO Classification of Tumors of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th Edition. Lyon: WHO 2017. 202p.
12. McGowan-Jordan J, Simons A, Schmid M. ISCN An International System for Human Cytogenomic Nomenclature. Paris: Karger 2016.
13. Marzocchi G, Castagnetti F, Luatti S, et al. Variant Philadelphia translocations: molecular-cytogenetic characterization and prognostic influence on frontline imatinib therapy, a GIMEMA Working Party on CML analysis. Blood 2011; 117: 6793-6800.
14. Wetzler M, Dodge RK, Mrózek K, et al. Additional cytogenetic abnormalities in adults with Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukaemia: a study of the Cancer and Leukaemia Group B. British Journal of Haematology 2004; 124: 275-288.
15. Thomas X, Olteanu N, Charrin C, et al. Acute lymphoblastic leukemia in the elderly: The Edouard Herriot Hospital Experimence. Am J Hematol 2001; 67(2): 73-83.
16. Raimondi SC, Zhou Y, Mathew S, et al. Reassessment of the prognostic significance of hypodiploidy in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia. Cancer 2003; 98(12): 2715-22.
17. Pan J, Xue Y, Wu Y, et al. Dicentric (7;9)(p11;p11) is a rare but recurrent abnormality in acute lymphoblastic leukemia: a study of 7 cases. Cancer Genet Cytogenet 2006; 169(2006): 159-63.