*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod
Príčiny patologického priebehu tehotenstva môžu byť rôzne. Po vylúčení genetickej, hormonálnej, anatomickej, infekčnej a hematologickej príčiny poruchy plodnosti sa testuje prítomnosť patologických mechanizmov imunitného systému. Tie zodpovedajú až za 40 – 60 % neobjasnených prípadov porúch plodnosti. Často sa na neplodnosti podieľa niekoľko faktorov súčasne. Imunitný systém má výraznú úlohu pri intolerancii plodu najmä u pacientok s už rozvinutým systémovým patoimunologickým stavom (imunodeficiencie, alergie, autoimunitné ochorenia). Reprodukčná schopnosť môže byť zasiahnutá abnormálne regulovanými funkciami na rôznych úrovniach. V zárodočných tkanivách muža aj ženy môže byť prítomná akútna aj chronická zápalová reakcia, ktorej výsledkom je lokálne znížená tolerancia semialogénneho plodu. U žien môže byť príčinou infertility autoimunitná (napr. systémový lupus erytematodus) aj aloimunitná reakcia organizmu(1).

Aloimunitné reakcie vznikajú v dôsledku poruchy v regulácii imunitných efektorov, ktorej výsledkom je reakcia namierená proti plodu namiesto navodenia tolerancie. Dôležitú úlohu pri neplodnosti má porušenie preklopenia pomeru TH1-/ TH2-lymfocytov. Ak sa hladina TH2-lymfocytov a cytokínov nimi
produkovaných (najmä IL-4) nezvýši na úroveň, ktorá dokáže zabezpečiť utlmenie embryotoxickej aktivity TH1-lymfocytov a ich efektorov, významne sa zvyšuje riziko odvrhnutia plodu materským organizmom. TH1-lymfocyty produkujú cytokíny, ktoré aktivujú ďalšie efektory namierené proti plodu.
Spomedzi nich je výrazná aktivácia NK-buniek a makrofágov. Z cytokínov, ktoré produkujú TH1-lymfocyty, má významnú úlohu pri aktivácii embryotoxických efektorov najmä IL-1 a IFN-γ. IFN-γ je okrem priameho toxického pôsobenia na plod schopný aktivovať trofoblast na tvorbu HLA-znakov.
Zvýraznený povrch trofoblastu je potom jednoduchší terč pre protilátky aj bunky s cytotoxickým pôsobením(1). TH1-lymfocyty produkujú aj IL-2 a TNF, ktoré spolu s IFN-γ pôsobia embryotoxicky, t. j. poškodzujú endotel cievneho zásobenia plodu. TNF pôsobí ako stimulátor programovanej smrti buniek
vilózneho trofoblastu. IFN-γ spôsobuje deštrukciu buniek trofoblastu mediovanú TNF(2). Spomínané mechanizmy rezultujú do prokoagulačných procesov, ktoré sa končia trombózou, ischémiou a smrťou plodu.
Autoimunitné reakcie môžu prebiehať proti zárodočným bunkám pohlavného systému žien aj mužov. Neplodnosť mužov môže byť zapríčinená autoprotilátkami proti spermiám aj imunitnými celulárnymi mechanizmami namierenými proti spermiám. U žien s poruchami plodnosti sa môžu nachádzať autoprotilátky proti ováriám, zona pellucida a protilátky proti spermiám. Z autoimunitných procesov, ktoré poškodzujú priamo plod, je najčastejší antifosfolipidový syndróm (APS). Pri APS sa vyskytujú v tele ženy antifosfolipidové protilátky proti β2-glykoproteínu I, ktorý je súčasťou membrán cievneho endotelu, protilátky proti anexínu V a množstvo iných. Aktivita antifosfolipidových protilátok spočíva v poškodzovaní
ciev v deciduu a placente, čo má za následok trombotické príhody a miestne infarkty(3). Pre každý z týchto stavov je potrebné stanoviť najefektívnejšiu
liečbu. V súčasnosti sa najčastejšie využíva liečba imunoglobulínmi alebo kortikosteroidmi. Každá z nich však nesie negatíva; imunoglobulíny sú nákladné a nie vždy sa nimi dosiahne uspokojivý účinok, na druhej strane kortikosteroidy majú široké spektrum nežiaducich účinkov, ktoré sa prejavujú u pomerne veľkého percenta užívateľov. Keďže neexistuje oficiálny algoritmus pre voľbu konkrétnej liečby pre dané problémy, lekári sa pri voľbe liečebnej schémy riadia skôr empiricky. Pri rastúcej incidencii porúch plodnosti je potrebné jednoznačne stanoviť, aké konkrétne liečivo a pri ktorých patologicky zvýšených parametroch bude metódou prvej voľby. Umožnilo by to rýchlejšiu a terapeuticky aj ekonomicky efektívnejšiu liečbu.

Metodika práce
V štúdii sme spracovali údaje z chorobopisov pacientok, ktoré sa liečili v imunologickom centre ImunoVital od novembra 2014 do februára 2016. Súbor pozostával z 81 žien v reprodukčnom veku, ktoré trpeli poruchami plodnosti, t. j. spontánnymi opakovanými potratmi alebo neplodnosťou
(neschopnosťou počať plod). Sledovaným pacientkam sa odobrala krv na komplexné imunologické vyšetrenie, na základe ktorého sme určili, ktoré parametre sa nachádzajú mimo referenčných hodnôt. Pacientky následne podstúpili jednu z troch skúšaných terapií: subkutánna aplikácia imunoglobulínov (liek Subcuvia), injekčná aplikácia dexametazónu (Dexamed) alebo perorálna aplikácia metylprednizolónu (Medrol). Dĺžka terapie sa pohybovala v rozmedzí 6 – 12 týždňov. Po tomto čase nasledovalo kontrolné imunologické vyšetrenie tých parametrov, ktoré vykazovali pri vstupnom
vyšetrení patologicky zvýšené hodnoty. Všetky laboratórne údaje sa získali z imunologického laboratória spoločnosti rozdelili do troch skupín, pričom kritériami na zaradenie do danej skupiny boli v 1. skupine zvýšené hodnoty IFN-γ alebo TNF, v 2. skupine zvýšené percento NK-buniek a v 3. skupine
zvýšené hodnoty antifosfolipidových protilátok nad referenčné hodnoty. Imunologické parametre sme spracovali Studentovým párovým t-testom v programe Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft, USA). Následne sme sa snažili určiť, ktorá liečba sa javí ako najvhodnejšia na úpravu jednotlivých patologicky zvýšených parametrov na fyziologické hodnoty.

Výsledky
Na základe stanovenia intracelulárnej hladiny IFN-γ v bunkách s povrchovými znakmi CD3+ a CD3+CD4+ sme zistili, že pri bunkách s CD3+ znakmi došlo k štatisticky významnému zníženiu hladiny IFN-γ pri všetkých typoch liečby (Subcuvia: pokles priemerne o 2,23 percentuálneho bodu (p = 0,026), Dexamed: pokles o 3,74 percentuálneho bodu (p = 0,0007), Medrol: pokles o 4,6 percentuálneho bodu (p = 0,004)) a pri bunkách s povrchovými znakmi CD3+CD4+ sme zaznamenali štatisticky signifikantný terapeutický efekt len pri liečbe Medrolom (pokles IFN-γ o 2,54 percentuálneho bodu (p = 0,019)).
Prehľad výsledkov uvádzame v tabuľke 1. V ďalšom kroku sme analogicky stanovili intracelulárne hodnoty TNF. Podávanie Subcuvie nejavilo štatisticky významné zníženie hladín TNF (p > 0,05). Po podávaní oboch kortikoidov došlo k štatisticky významnému poklesu hladín TNF (Dexamed: v bunkách so znakmi CD3+ pokles o 5,01 percentuálneho bodu (p = 0,002) a v bunkách s CD3+CD4+ znakmi pokles o 6,20 percentuálneho bodu (p = 0,002), Medrol: v bunkách s CD3+ znakmi pokles o 5,96 percentuálneho bodu (p = 0,022) a v bunkách so znakmi CD3+CD4+ pokles o 5,73 percentuálneho bodu (p = 0,025)). Prehľad výsledkov znázorňuje tabuľka 2.
Následne sme stanovili pomer TH1-/TH2-lymfocytov, ktorý bol reprezentovaný pomerom cytokínov produkovaných TH1-lymfocytmi (IFN-γ a TNF) k principiálnemu cytokínu produkovanému TH2-lymfocytmi (IL-4). Pri sledovaní pomeru IFN-γ/IL-4 (CD3+) sme odhalili pri všetkých skúšaných liekoch štatisticky významné zvýšenie pomeru v prospech TH1-lymfocytov (Medrol: nárast pomeru o 3,78 jednotky v prospech IFN-γ (p = 0,00002), Dexamed: nárast o 2,69 jednotky (p = 0,026), Subcuvia: nárast o 2,19 jednotky (p = 0,003) (graf 1). Analogicky sme postupovali aj pri bunkách nesúcich
povrchové markery CD3+CD4+ (Medrol: nárast pomeru o 6,67 jednotky, Subcuvia a Dexamed nss (p > 0,05). Ďalej sme sledovali pomer TH1-/TH2-lymfocytov prezentovaný cytokínmi TNF a IL-4 pri bunkách s CD3+ znakmi (Medrol: nárast pomeru TNF/IL-4 o 4,54 jednotky (p = 0,0001), Dexamed: nárast pomeru o 3,62 jednotky (p = 0,013), Subcuvia: nárast o 3,21 jednotky (p = 0,004)) (graf 2) a CD3+CD4+
znakmi (Medrol: nárast o 8,52 jednotky (p = 0,00003), Dexamed a Subcuvia nss (p > 0,05).
Ďalším z cieľov štúdie bolo porovnať populáciu NK-buniek (CD3-CD56+). Dexamedom bola liečená iba jedna pacientka, preto sme ho nezahrnuli do štatistického spracovania dát (populácia NK-buniek pred liečbou 17,77 %, po liečbe pokles na 8,37 %). Významný bol pokles NK-buniek po liečbe
Medrolom, priemerne pokles o 8,84 percentuálneho bodu (p = 0,011). Pri liečbe Subcuviou neboli pozorovane štatisticky signifikantné zmeny v populácii NK-buniek (graf 3). V poslednej časti štúdie sme monitorovali hladiny antifosfolipidových protilátok (APA). Najvyššiu úspešnosť dosiahla liečba Dexamedom, ktorú podstúpilo 6 pacientok (n = 5 pokles APA na referenčné hodnoty, n = 1 bez odpovede). Liek Subcuvia sa podával 3 pacientkam (n = 2 pokles APA na fyziologické hodnoty, n = 1 bez odpovede). Perorálnym kortikosteroidom Medrol sa liečilo 9 pacientok (n = 4 úprava hladín APA na fyziologické, n = 5 bez odpovede).

Diskusia
Ako prvé sme u pacientok s imunologicky zapríčinenými poruchami plodnosti porovnávali hodnoty prozápalových TH1 cytokínov (IFN-γ, TNF) pred liečbou a po 6 – 12 týždňoch liečby Subcuviou, Dexamedom a Medrolom. Dostupné zdroje uvádzajú, že vhodnými liečivami na zníženie hladín daných cytokínov sa zdajú imunoglobulíny a glukokortikoidy(4). Z našich výsledkov vyplýva, že liečba metylprednizolónom (Medrol) má najvýraznejší efekt na zníženie zvýšených hodnôt IFN-γ. Zvýšené hodnoty TNF sa účinne znížili aplikáciou kortikosteroidov, pričom účinnosť dexametazónu a metylprednizolónu sa zdá podobná. Z výsledkov možno usudzovať, že pri zvýšených hodnotách TH1 cytokínov je najvhodnejšia liečba perorálne podávaným metylprednizolónom. Táto liečba je zároveň najlacnejšia a najjednoduchšie sa aplikuje, čo môže prispieť k zvýšeniu kompliancie pacientok.
V ďalšej časti práce sme vytvorili pomer TH1-/TH2-lymfocytov na základe pomeru cytokínov produkovaných týmito bunkami, t. j. pomer IFN-γ/IL-4 a TNF/IL-4. Dalo by sa očakávať, že keď jednotlivé liečivá znižujú hodnoty prozápalových TH1 cytokínov, pomer TH1-/TH2-lymfocytov sa bude znižovať.
Výsledkom liečby však bolo vo všetkých prípadoch zvýšenie pomeru v prospech TH1-lymfocytov. Dá sa to vysvetliť tým, že aj keď hodnoty prozápalových cytokínov klesajú, hodnoty tlmivého IL-4 klesajú ešte výraznejšie. Je diskutabilné, či má zmysel sledovať pomer TH1-/TH2-lymfocytov pred samotným počatím. Až do momentu oplodnenia je pre telo fyziologické, že TH1-lymfocyty v krvi prevládajú – svojím pôsobením zabezpečujú boj proti cudzorodým antigénom, ktorý je nevyhnutný na zachovanie integrity organizmu. Až po oplodnení nastáva fyziologické preklopenie pomeru v prospech tlmivých TH2-lymfocytov. Výsledky môžu byť nápomocné v prípadoch, keď sú okrem zvýšených TH1 cytokínov zároveň znížené hodnoty TH2 cytokínov. V týchto prípadoch je dôležité, aby liečba popri znižovaní prozápalových cytokínov neviedla k ešte výraznejšiemu prehĺbeniu deficitu
tlmivých TH2 cytokínov. Keďže pomer TH1-/TH2-lymfocytov vo všetkých skupinách najmenej zvyšovala liečba imunoglobulínmi
(Subcuvia), v týchto situáciách sa zdá vhodnou voľbou. Mimo týchto prípadov snahou zostáva čo najviac znížiť TH1 cytokíny, ktoré pre svoje embryotoxické pôsobenie predstavujú pre tehotenstvo väčšie riziko. Najvýraznejšia redukcia zvýšenej populácie NK-buniek sa dosiahla pri liečbe kortikosteroidmi. Tieto výsledky súhlasia s výsledkami viacerých publikovaných štúdií(5). Aj keď vo všeobecnosti sa žiadne z používaných liečiv nepovažuje za
špecifické pre NK-bunky, za najúčinnejšie sa pokladajú imunoglobulíny a metylprednizolón(6). Pri zvýšených hodnotách APA dosiahla najvyššiu úspešnosť
liečba Dexamedom. Viaceré dostupné štúdie porovnávali úspešnosť liečby pacientok s APA počas tehotenstva. Vaquero a kol. dokázali približne rovnakú účinnosť prednizónu a imunoglobulínov pri značne nižšom počte tehotenských komplikácií u IVIg(7). Výsledky našej práce potvrdzujú úspešnosť
liečby imunoglobulínmi, výraznejší efekt sa však ukázal pri liečbe dexametazónom.

Záver
Snahou tejto práce bolo priniesť závery, ktoré by pomohli lekárom s voľbou vhodného liečiva a slúžili ako základ pre ďalšie skúmanie problematiky. Je samozrejmé, že v oblasti medicíny pracujeme s výraznou interindividuálnou variabilitou a odpoveď každej pacientky na tú istú liečbu sa môže líšiť. Preto zdôrazňujeme potrebu širšieho výskumu problematiky na väčšej vzorke pacientok. Výsledkom ďalších výskumov by tak mohlo byť zostavenie algoritmu na liečbu porúch plodnosti, ktorý na poli slovenskej medicíny absentuje.