*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Krvné doštičky sú bezjadrové úlomky cytoplazmy vznikajúce z megakaryocytov v kostnej dreni. Denná produkcia krvných doštičiek je 1,2 – 1,5 x 1011, v periférnej krvi sa nachádzajú v priemernom počte 150 – 400 x 109/l a majú objem 6 – 12 fl(1). V panoptickom krvnom nátere sa zobrazujú doštičky ako oválne alebo okrúhle objekty s priemernou veľkosťou 1,5 – 3 µm. V ich strede sa nachádzajú červeno-fialové granuly (granuloméry) obklopené jemne bazofilnou cytoplazmou (hyaloméra), ktorá je ohraničená plazmatickou membránou(2).

Na povrchu membrány krvnej doštičky sa nachádza veľké množstvo receptorov, ktoré slúžia na zachytenie signálu, zabezpečujú jeho prenos a podieľajú sa na prestupe látok cez membránu. Popri bežných membránových receptoroch majú na povrchu doštičiek dôležitú úlohu glykoproteíny. Zmeny štruktúry a funkcie glykoproteínov krvných doštičiek môžu spôsobovať poruchy zrážania krvi(3). Biologické procesy regulované doštičkami sú tiež sprostredkované membránovými glykoproteínmi (GP), ktoré sa označujú rímskymi číslicami, a ich podskupiny malými arabskými písmenami. V súčasnosti je známych viac ako 50 membránových glykoproteínov, pričom každý glykoproteín po obsadení svojho väzbového miesta zabezpečuje priebeh určitého deja. Na membráne sa nachádzajú aj receptory slúžiace na naviazanie aktivačných a stimulačných látok koagulácie(4,5).

P-selektín, GMP-140 (CD62P) je membránový glykoproteín granúl krvných doštičiek, patrí k adhezívnym molekulám. V pokojovom stave sa nachádza v membránach α-granúl a v endoteli vo Weibelových-Paladeho telieskach. Po aktivácii je P-selektín uvoľnený z granúl. Pokojové doštičky exprimujú asi 1 000 molekúl P-selektínu, aktivovaných je viac ako 10 000 molekúl. Exponovaný P-selektín sa zúčastňuje na eliminácii aktivovaných krvných doštičiek z cirkulácie a sprostredkuje adhéziu neutrofilov a monocytov na tromby a endotelové bunky(6,7).

Prietoková cytometria je proces, ktorý umožňuje kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu optických a fluorescenčných vlastností jednotlivých buniek alebo iných častíc v suspenzii. Prietokový cytometer sa skladá z fluidného, optického a počítačového systému. Výsledkom analýzy je v našom prípade graficky znázornená (ko)expresia povrchových glykoproteínov v populácii krvných dostičiek a dostupná súhrnná štatistika. S cieľom posúdiť aktiváciu krvných doštičiek môžeme použiť testovanie povrchovej expresie aktivačného znaku CD62P pomocou väzby fluorescenčne značenej monoklonálnej protilátky namierenej proti tomuto antigénu, vizualizovanej prietokovou cytometriou.

Le Minh a kolektív sledovali prvé príznaky aktivácie trombocytov po indukcii ADP a porovnali dve metódy založené na morfologických a biochemických markeroch(8). Skenovacia elektrónová mikroskopia krvných doštičiek sa uskutočňovala paralelne s prietokovou cytometriou, aby sa kvantifikovala povrchová expresia P-selektínu, aktívneho αIIbβ3-integrínu a fosfatidylserínu. Na základe získaných výsledkov boli sledované zmeny tvaru najcitlivejšie na nízku koncentráciu ADP v porovnaní s biochemickými markermi v nasledujúcom po- radí citlivosti: morfologické zmeny > väzbová kapacita fibrinogénu > expresia P-selektínu > expozícia fosfatidylserínu. Tieto výsledky poukazujú na vyššiu citlivosť krvnej doštičky a výhody využitia prietokovej cytometrie na detekciu povrchovej expresie P-selektínu ako markera aktivácie krvných doštičiek.

Využitie prietokovej cytometrie zamerané na štúdium prokoagulačných krvných doštičiek v pokojových a agonistom stimulovaných podmienkach v celej krvi a premytých krvných doštičiek ľudských a myších vzoriek opisuje vo svojej práci Than a kol.(9).

Vyšetrenia glykoproteínov trombocytov majú význam v posudzovaní stavov s trombocytovou hypo- a hyperreaktivitou a pri diferenciálnej diagnostike trombocytopénií. Znížená expresia GPIIb/IIIa, t. j. CD41/CD61, svedčí o Glanzmannovej trombasténii, pri zníženej expresii GPIb/V/IX, t. j. CD42b/ CD42a, ide o Bernardov-Soulierov syndróm. V uvedených prípadoch ide o hereditárne trombocytopénie, ale vyšetrenie glykoproteínov trombocytov sa odporúča aj pri stavoch s ich hyperreaktivitou (aterosklerotické cievne ochorenia, diabetes mellitus, arteriálne a venózne trombózy, umelé chlopne, chronické zápalové črevné ochorenia, systémové ochorenia) alebo hyporeaktivitou (vrodené defekty receptorov trombocytov, renálne a hepatálne insuficiencie, esenciálne trombocytémie. Väčšinou sa hodnotia zmeny adhezívnych receptorov ako GPIb, t. j. CD42b/CD42a, GPIIb/GPIIIa, t. j. CD41/ CD61, a aktivačných markerov GMP 140, t. j. CD62P, GP53, j. CD63, trombospondínový receptor CD36(10).

Materiál a metodika

Príprava vzorky

Vzorku krvi na analýzu doštičkových glykoproteínov sme pacientom odobrali do jednorazovej vakutajnerovej skúmavky s antikoagulantom 3,2 % (0,109 mol/l) citrónanom sodným. Skúmavku s krvou sme centrifúgovali pri 200 g 10 minút.

PRP sme oddelili od krviniek do inej skúmavky.

Metóda

Doštičkové glykoproteíny sme analyzovali na prietokovom cytometri FACSVerse (Becton Dickinson and company, San Jose, USA). Pre povrchovú imunofenotypizáciu sme použili techniku dvojitého priameho značenia fluorinovanými monoklonálnymi protilátkami: anti-CD42a/FITC (clone SZ1, Beckman Coulter, San Diego, USA), anti-CD62P/PE (clone AC1.2, Becton Dickinson).

Naším cieľom bolo zistiť, či metóda stanovenia doštičkových glykoproteínov v PRP, ktorá je považovaná za zlatý štandard, ovplyvňuje expresiu CD62P na doštičkách. Vychádzali sme z predpokladu, že plazmu bohatú na doštičky pripravujeme centrifugáciou celej krvi, čím môžeme spôsobiť čiastočnú aktiváciu doštičiek. Každému z 50 zdravých darcov krvi bola stanovená expresia CD62P v celej krvi a súčasne v PRP. Ako pozitívnu kontrolu sme použili aktivované krvné doštičky, ktoré sme aktivovali ADP s finálnou koncentráciou 10 µM (CD42b-FITC/CD62P-PE). Ako negatívnu kontrolu sme použili izotypovú kontrolu IgG1/IgG2 (FITC/PE).

Výsledky

Obrázok 1 ukazuje spôsob analýzy a rozdiel medzi expresiou CD62P na doštičkách charakterizovaných pomocou rozptylových parametrov (FSC a SSC, oblasť „doštičky“) a expresiou antigénu CD42a v celej krvi (A, C) a v PRP (B, D). Čísla v jednotlivých kvadrantoch štatisticky v C a D vyjadrujú percentuálne zastúpenie jednotlivých populácií objektov z oblasti „doštičky“, zastúpenie CD62P – pozitívnych doštičiek bolo určené ako 100 % x (%Q2)/(%Q2 + %Q4). V prípade uvedenom na obrázku č. 1 spôsobila príprava PRP zdvojnásobenie zastúpenia CD42+CD62P+ doštičiek v PRP vzorke (16,7 %) v porovnaní so vzorkou celej krvi (8,5 %).

Diskusia

Jedným z cieľov práce bolo porovnať dve metódy analýzy krvných doštičiek, a to stanovenie expresie doštičkových glykoproteínov v celej krvi a v PRP u zdravých darcov (v kontrolnej skupine).

Porovnaním oboch metód na základe stanovenia koexpresie CD42a/CD62P znázornené na obrázku 1 sme zistili štatistickú významnosť CD42a/CD62P v PRP oproti celej krvi (P < 0,0005; graf 1).

Na základe získaných štatistických výsledkov sa javí metóda stanovenia doštičkových glykoproteínov v celej krvi praktickejšia a šetrnejšia pre krvné doštičky než metóda stanovenia v PRP. Porovnaním analýz expresie CD42a-FITC/ CD62P-PE v celej krvi a v PRP v kontrolnej skupine sme zistili, že izolácia PRP vplýva na aktiváciu doštičiek do takej miery, že rozdiel je oproti metóde v celej krvi štatisticky významný s hodnotou P ˂ 0,0005. Expresia CD62P na doštičkách v PRP je v porovnaní s expresiou CD62P na doštičkách v celej krvi štatisticky významne zvýšená.

Záver

Porovnaním analýz expresie CD42a-FITC/CD62P-PE v celej krvi a v PRP v kontrolnej skupine sme zistili, že izolácia PRP vplýva na aktiváciu doštičiek do takej miery, že rozdiel je oproti metóde v celej krvi štatisticky významný s hodnotou P ˂ 0,0005. Expresia CD62P na doštičkách v PRP je v porovnaní s expresiou CD62P na doštičkách v celej krvi štatisticky významne zvýšená.

Použitím metódy analýzy doštičkových glykoproteínov v celej krvi sa priblížime podmienkam in vivo a minimalizujeme aktiváciu doštičiek.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená projektami APVV – 16-0020, Vega 1/0168/16, Vega 1/0187/17 a Centra excelentnosti pre perinatologický výskum (CEPV II, ITMS 26220120036) a Centra excelentnosti pre výskum v personalizovanej terapii (CEVYPET).

LITERATÚRA

1. Penka M a kol. Hematologie a transfuzní lékařství I. Grada Publishing, s., 2011, 33.
2. Sakalová A a kol. Hematológia a transfúziológia, Vydavateľstvo Osveta, 1995, 102-103.
3. Nosáľ R, Jančinová V. Krvné doštičky v biológii a medicíne. Veda, Vydavateľstvo Slovenskej akadémie vied, Bratislava, 1990, 15-16.
4. Evans WH, Graham Memrane structure and function. Oxford, England: Oxford IRL Press, Oxford University Press, 1988, 11-29.
5. Staško J, Bartošová L, Mýtnik M, Kubisz P. Are the platelets activated in sticky platelet syndrome? Thromb Res, 2011, 128: 96-97.
6. Curvers J, de Wildt-Eggen J, Heeremans J, et Flow cytometric measurement of CD62P (P-selectin) expression on platelets: a multicenter optimization and standardization effort. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1439-46.
7. Vučetić D, Ilić V, Vojvodić D, et al. Flow cytometry analysis of platelet populations: usefulness for monitoringthe storage lesion in pooled buffycoat platelet Blood Transfus. 2018 Jan;16(1):83-92.
8. Le Minh G, Peshkova AD, Andrianova IA, et Differential sensitivity of various markers of platelet activation with adenosine diphosphate.Bionanoscience. 2019 marec; 9 (1): 53-58. Epub 2018, 10. decembra.
9. Tan CW, Bourcy M, Pasalic L, Chen VM. Flow Cytometry Assessment of Procoagulant Platelets Using a Dithiol-Reactive Probe. Methods Mol Bi- 2019;1967:305-321.
10. Kubisz P a Hematológia a transfúziológia, Grada Publishing, a. s., 2006, 257-260.