*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Výskyt chronických ochorení pečene (COP) v dnešnej mo­dernej dobe narastá a celosvetovo predstavujú poprednú prí­činu mortality. Špecifické postavenie pečene v centre me­tabolických funkcií organizmu a unikátne krvné zásobenie predisponujú tento orgán na viacnásobné potencionálne rizi­ko poškodenia. Pečeň je atakovaná vírusmi, toxínmi (alkohol, lieky, drogy) a naším nezdravým a rýchlym životným štýlom, ktorý zahŕňa fyzickú inaktivitu, nadbytočný príjem kalórií, ne­zdravý fastfood alebo prechemizované potraviny. Nie je pre­kvapením, že najčastejšími príčinami COP sú vírusové hepa­titídy typu C a B (VHC, VHB), nealkoholová tuková choroba pečene (NAFLD) a alkoholová choroba pečene (ALD). Kým mortalita na kardiovaskulárne, onkologické a respiračné cho­roby vykazuje stabilizovaný, až mierne klesajúci trend, morta­lita na COP narastá.

V súčasnosti je takmer 30 miliónov obyvateľov Európy postihnutých rôznymi formami COP. Vírusom hepatitídy C je v európskych krajinách infikovaných 19 miliónov z celkového počtu 750 miliónov obyvateľov, pričom prevalencia infekcie v jednotlivých krajinách kolíše medzi 0,15 – 3,26 %⁽¹⁾. Preva­lencia NAFLD, najčastejšej hepatopatie v európskej populá­cii, kolíše v dospelej populácii medzi 4 – 49,6 % a u pacien­tov s diabetom 2. typu medzi 42,6 – 69,5 %⁽²³⁾.

Súčasťou štrukturálnych a funkčných zmien pri chronic­kých ochoreniach pečene je fibróza, ktorá priamo koreluje s rizikom vzniku cirhózy a jej komplikácií (portálna hypertenzia, hepatocelulárny karcinóm). Stupeň fibrózy predsta­vuje najvýznamnejší prognostický faktor COP Manažment pacientov s COP zahŕňa potvrdenie a staging fibrózy, ktorý identifikuje jedincov so zvýšeným rizikom progresie do cirhó­zy, a tiež grading fibrózy, ktorý posúdi stupeň zápalovej alebo metabolickej odpovede a v prípade VHC predikuje pravdepo­dobnosť dosiahnutia trvalej liečebnej odpovede na antiviro­tickú liečbu⁽⁴⁾.

Fibrogenéza

Pečeňovú fibrózu možno definovať ako štrukturálnu pre­stavbu tkaniva s nadmerným ukladaním väzivovej hmoty. Fy­ziologickou reakciou na nekrózu či apoptózu hepatocytov je aktivácia zápalovej kaskády a následne fibrogenézy. Tento proces zahŕňa ukladanie extracelulárnej hmoty (ECM), ktorá vedie k oprave a regenerácii, ak je vyvážená fibrolýzou. Fibro­genéza aj fibrolýza sú indukované a udržiavané pôsobením viacerých typov pečeňových buniek, ktoré sa aktivujú rôzny­mi vyvolávajúcimi príčinami (obrázok 1).

Kľúčové postavenie medzi špecializovanými bunkami pečeňovej fibrogenézy majú hviezdicovité bunky, nazýva­né aj perisínusoidálne lipocyty alebo Itove bunky, ktoré sú schopné premeny na myofibroblasty. K aktivácii a proliferácii hviezdicovitých buniek prispieva celá plejáda profibrogénnych a promitogénnych faktorov uvoľňovaných z iných typov buniek, napr. hepatocytov (IL-33), Kupferových buniek (TGF-p, TGF-a – transforming growth factor-p, a), trombocytov (PDGF – platelet-derived growth factor, TGF-p), endotelových sínusoidálnych buniek (endotelín), monocytov a ďalších prevažne zápalových buniek (CTGF – connective tissue derived growth factor, INF-y, IL1-p, CD163).

Extracelulárna hmota pozostáva z 2 typov makromolekúl: a. kolagénov typu I, III, V a VI a b. nekolagénových molekúl: glykoproteínov (fibronektín, laminin, tenascín), proteoglykánov a glykozaminoglykánov (kyselina hyalurónová, chondroitínsulfát, dermatansulfát). Počas fibrogenézy pribúda v pe­čeni kolagén typu I, ktorého podiel sa zvyšuje až na 60 – 70 % celkového kolagénu, kým v zdravej pečeni sú kolagény I a III zastúpené v pomere 1 : 1.

Rozvoj pečeňovej fibrózy je výsledkom nerovnováhy me­dzi zvýšenou tvorbou ECM a jej zníženým odbúravaním. Na odbúravaní ECM sa zúčastňujú tkanivové enzýmy, metaloproteinázy (MMP), ktorých funkciu modulujú viaceré tka­nivové inhibitory (TIMP-1, -3)⁽⁵⁾. V situácii, keď fibrogenéza prevažuje nad fibrolýzou, napr. pri pretrvávaní etiologického faktora, prejaví sa patologickým zmnožením väzivového tka­niva, vaskulárnymi aj nodulárnymi regeneratívnymi zmena­mi, vedúcimi k poruche štruktúry a následne funkcie pečene.

Diagnostika fibrózy

Pečeňová biopsia ostáva historicky zlatým štandardom v určovaní tzv. stagingu a gradingu pečeňového ochorenia vírusovej aj nevírusovej etiológie. V prvom prípade sa hod­notí stupeň zápalu a nekrózy hepatocytov, v druhom stupeň zjazvenia, t. j. rozsah periportálnej fibrózy až cirhózy. Z mno­hých histologických stupníc na hodnotenie fibrózy pečene sa najčastejšie používa skórovací systém Ishak a Metavir, oba vyvinuté pre vírusové hepatitídy (tabuľka 1).

Nevýhodou biopsie je jej invazivita, subjektivita pri hodno­tení nálezu, bolestivosť, emočná záťaž u pacienta (strach), zriedkavo aj krvácavé komplikácie. Príčinou veľkých intra- a interindividuálnych rozdielov v hodnotení (až do 38 %) je najčastejšie nedostatočná veľkosť vzorky, jej nehomogenita a miesto odberu. V snahe optimalizovať význam pečeňo­vej biopsie pri hodnotení fibrózy sú navrhnuté odporúčania týkajúce sa dĺžky (> 15 mm s minimálne 5 portobiliárnymi priestormi), priemeru vyšetrovanej vzorky (> 16 nm), použi­tia vhodného skórovacieho systému a erudovanosti hodno­tiaceho patológa⁽⁴⁾.

U pacientov s NAFLD sa navyše vzhľadom na vysoký vý­skyt steatózy s nízkym rizikom progresie do cirhózy biopsia pečene nepovažuje za vhodný test prvej voľby⁽⁶⁾.

Sérové a zobrazovacie neinvazívne markery

V posledných dvoch desaťročiach sa intenzívne skúma­li neinvazívne metódy hodnotenia pečeňovej fibrózy a cirhó­zy najmä s ohľadom na riziká, obmedzenia a kontraindikácie pečeňovej biopsie. Ich diagnostickú efektivitu vyjadruje vypočítaná hodnota plochy pod operačnou krivkou AUROC (Area Under the Receiver Operating characteristic Curve), ktorá sa vzťahuje k referenčnému štandardu – biopsii peče­ne. Skúmaný diagnostický test či metóda sa vo všeobecnos­ti hodnotí ako dobrý, ak hodnota AUROC dosahuje viac ako 80 % a ako excelentný, ak AUROC je viac ako 90 %.

Neinvazívne metódy hodnotenia pečeňovej fibrózy sa de­lia na dve skupiny: 1. kvantitatívne stanovované sérové bio­markery, ktoré viac alebo menej odrážajú zmeny v pečeni a 2. meranie tuhosti pečene (elastografia), ktorá odráža fyzikálne vlastnosti pečeňového tkaniva zmeneného fibrózou.

Sérové biomarkery

Viaceré biomarkery boli identifikované ako vhodné indi­kátory pečeňovej fibrózy. Žiaden z nich nespĺňa kritériá na ideálny biomarker, ale ich diagnostická hodnota sa výrazne zvyšuje, ak sú použité v kombináciách. Sérové markery pe­čeňovej fibrózy možno rozdeliť do dvoch základných skupín: Nepriame markery – prevažne široko dostupné tzv. hepatálne testy, ktoré len nepriamo odrážajú produkciu a kvanti­tu väziva v pečeni a ich koncentrácie v krvi sa menia sekun­dárne v dôsledku zmien štruktúry pečene či sleziny a nárastu portálneho tlaku:

• tradičné „pečeňové“ enzýmy odrážajúce poruchu integri­ty až nekrózu hepatocytov (AST, ALT) alebo cholestázu (GMT, ALP);
• markery odrážajúce sekundárny hypersplenizmus ale­bo zníženú syntézu koagulačných faktorov (trombocyty, protrombínový čas, INR – International Normalized Ratio);
• proteíny syntetizované alebo degradované pečeňou (a2-makroglobulín, albumín, feritín, imunoglobulíny);
• zápalové cytokíny, o ktorých je známe, že pochádzajú z he­patocytov alebo aktivovaných zápalových buniek v pečeni (IL-6, TNF-a a pod.)

Priame markery – pochádzajú priamo z procesu fibrogenézy a v krvi sa zvyšujú v dôsledku ich zvýšeného vychytáva­nia v hepatálnych sínusoidoch. V klinickej praxi sa doposiaľ najviac študovali nasledujúce (prehľad v 7):

N-terminálny peptid prokolagénu typu III (PIIINP) – je markerom fibrogenézy. Odštepuje sa enzymaticky z moleku­ly prokolagénu III pred jeho integráciou do ECM. Nevýhodou markera je jeho nízka špecifickosť pre pečeň a možná inter­ferencia fibrózy iného pôvodu (pľúca, obličky, črevo a pod.)

Kyselina hyalurónová (HA) – glykozaminoglykán prítom­ný v ECM, je rovnako priamym markerom fibrogenézy. V štú­diách s rôznymi typmi COP, avšak najmä pri chronickej VHC a NAFLD, bola potvrdená jej schopnosť detegovať pokročilú fibrózu, cirhózu a tiež poklesom reagovať na úspešnú liečbu pacientov s VHC.

Metaloproteinázy (MMP-1, -2, -9) – 3 enzýmy typu kolagenáz a gelatináz, ktoré sa priamo zúčastňujú na degradá­cii ECM. Ich koncentrácia v krvi nepriamo koreluje so závaž­nosťou fibrózy aj nekrózy pečene. V klinickej praxi sa veľmi neosvedčili.

Tkanivový inhibítor metaloproteinázy-1 (TIMP-1) – je­den z viacerých tkanivových proteínov, ktorých koncentrácia v krvi odráža intenzitu fibrogenézy. Zvýšené hodnoty TIMP-1 boli opakovane referované v rôznych štádiách fibrózy najmä u pacientov s chronickou VHC.

Cytokíny a chemokíny priamo viazané na proces fibrózy pečene boli študované najmä vo vzťahu k progresii ochore­nia. TGF-p je najdôležitejším stimulátorom ukladania ECM. TGF-a podporuje proliferáciu pečeňových hviezdicovitých bu­niek a PDGF sa zdá najúčinnejším mitogénom hviezdicovi­tých buniek in vitro. Všetky pôsobky preukázali koreláciu so stupňom fibrózy a/alebo zápalu.

Nevýhodou všetkých spomenutých priamych markerov je ich nízka orgánová špecifickosť pre pečeň a možná interfe­rencia fibrózy iného pôvodu (pľúca, črevo a pod.) Biochemic­ké markery pečeňovej fibrózy boli v početných štúdiách validované najmä pre pacientov s chronickou VHC, VHB, NAFLD, v menšej miere pre iné chronické ochorenia pečene, napr. al­koholovú chorobu pečene a len ojedinele pre zriedkavé auto- imunitné alebo metabolické pečeňové ochorenia.

Boli vypracované mnohé matematické modely založené na kombináciách priamych a nepriamych sérových marke­rov, prípadne na kombinácii sérových markerov a zobrazova­cích elastografií, ktoré sa rôznou mierou stali súčasťou rutin­nej praxe v hepatológii (tabuľka 2). Mnohé vzorce na výpočet skóre sú patentované (FibroTest, Hepascore, FibroMeter), iné sú nepatentované (napr. APRI, Fornosov index, FIB-4). Tieto rozhodovacie algoritmy umožnili neinvazívnym spôso­bom kategorizovať viac ako 90 % pacientov do kategórií níz­kej, stredne závažnej a závažnej fibrózy. Treba zdôrazniť, že väčšina biomarkerov opísaných v literatúre má schopnosť predikovať pokročilú fibrózu (> 2 Ishak alebo > 2 Metavir), ale v porovnaní s pečeňovou biopsiou neodlíši dostatočne presne počiatočné štádiá fibrózy a zdravú pečeň.

U pacientov s NAFLD malo najväčšiu diagnostickú efekti­vitu použitie modifikovaného FibroMeter testu alebo NAFLD skóre počítaného pomocou online kalkulátora, FIB-4 alebo APRI index mali nižšiu senzitívnosťa špecifickosť⁸⁹/ Najviac údajov o validácii sérových biomarkerov pečeňovej fibrózy je u pacientov s chronickou VHC. Slovenskí autori tiež prispe­li k vytvoreniu vlastného skórovacieho systému NSF (neinvazívne skóre fibrózy), ktorý bol validovaný na 104 pacientoch s VHC pred plánovanou liečbou⁽¹⁰⁾.

Medzi skórovacie systémy založené na meraní priamych biomarkerov, presadzované v súčasnosti, patrí tzv. ELF (En­hanced Liver Fibrosis) test, ktorý je súčasťou NICE odpo­rúčaní pre manažment COP vo Veľkej Británii a v praxi po­užívaný tiež v Austrálii⁽¹¹⁾. Test je založený na výpočte ELF skóre z meraných sérových markerov syntézy a odbúrava­nia extracelulárnej hmoty kyseliny hyalurónovej, PIIINP a TIMP-1. Podobne ako mnohé ďalšie modely výpočet ELF skóre zohľadňuje vek a pohlavie pacienta. Viaceré štúdie deklarovali schopnosť ELF skóre rozlíšiť závažnú, miernu a žiadnu fibrózu pečene (AUROC 0,90 – 0,82 – 0,76) a predikovať komplikácie COP⁽¹²¹³⁾. Neinvazívny ELF test bol po­užitý aj v nedávnej štúdii Tanwara a kol. na monitorovanie 24-mesačnej antivirotickej liečby u pacientov s chronickou VHC (pred liečbou, po 12 a 24 mesiacoch), ktorí podstúpi­li aj biopsiu pečene na začiatku a na konci sledovaného obdobia⁽¹⁴⁾. Absolútne zmeny hodnôt ELF skóre po 12 mesia­coch signifikantne korelovali so zmenami ELF aj histológie po 24 mesiacoch. Výsledky tejto štúdie naznačujú, že zme­ny sérových biomarkerov predikujú vývoj pečeňovej fibrózy účinkom liečby v zmysle jej regresie (AUROC 0,81 – 0,84) aj progresie (AUROC 0,86 – 0,91). Porovnanie priamych a ne­priamych sérových biomarkerov ukázalo, že ich diagnostic­ká efektivita pri predikcii fibrózy pečene je porovnateľná, av­šak náklady, a tým aj dostupnosť priamych biomarkerov sú oveľa vyššie⁽¹⁵¹⁶⁾. Vo väčšine európskych krajín nie sú priame markery fibrózy hradené zo zdravotného poistenia, preto sú skúsenosti s ich využitím v rutinnej klinickej praxi minimálne.

Zobrazovacie metódy na posúdenie fibrózy

Tranzientná ultrazvuková elastografia (TE) je neinvazívna metóda merania tuhosti pečeňového tkaniva, ktorá sa zvy­šuje so závažnosťou fibrózy aj so stúpajúcou vaskulárnou rezistenciou a portálnym venóznym tlakom. Metóda vyžíva vysokofrekvenčný ultrazvuk (MHz) a sondu, ktorá generuje a emituje do pečene nízkofrekvenčné vibrácie (50 Hz). Rých­losť šírenia týchto vibrácií je priamoúmerná tuhosti tkaniva, ktorá je vyjadrená v kilopascaloch (kPa). Senzitívnosť a špe­cifickosť TE je vysoká u pacientov s cirhózou (až do 90 %), av­šak u pacientov so stredne závažnou až pokročilou fibrózou (F2 – F4) TE dosahuje len 70 % senzitivitu a 80 % špecificitu. Cut-off hodnoty TE na potvrdenie cirhózy u pacientov s chro­nickou VHC kolíšu v rozmedzí 11 – 17 kPa⁽¹⁷¹⁸⁾.

Modernou metódou na stanovenie elastických vlastnos­tí pečeňového parenchýmu je aj magnetická rezonancia vo forme tzv. MR elastografie. Podobne ako TE metóda využí­va mechanické vibrácie s frekvenciou 40 – 90 Hz, generova­né pomocou zdroja nízkofrekvenčných vĺn. Po prechode pe­čeňou tieto vlny spôsobujú pohyby častíc a druhotné vlnenie, ktoré je zachytávané špeciálnymi MR technikami a softvé­rom na generovanie MRE obrazov vznikajú MRE elastogramy. Senzitivita MRE pre štádiá fibrózy F2 až F4 podľa Metaviru bola 98 %, 95 % a 100 %⁽¹⁹⁾.

Porovnanie neinvazívnych markerov fibrózy pečene

Priame a nepriame sérové biomarkery boli porovnávané navzájom aj vo vzťahu k TE v desiatkach štúdií. Metaanalýza Hounota a kol. (2016) 71 štúdií z obdobia 2001 – 2014 sys­tematicky preskúmala pomocou matematicko-štatistických metód priame porovnania štyroch najčastejšie používaných a diskutovaných neinvazívnych metód u pacientov s chronic­kou VHC a VHB, a to FibroTest, APRI a FIB-4 skóre a tranzientnú elastografiu⁽²⁰⁾. Ich analýza potvrdila lepšiu diagnos­tickú efektivitu FibroTestu v porovnaní s APRI, FIB-4 a TE pri diagnóze závažnej fibrózy, kým pri diagnóze cirhózy sa testy nelíšili. Toto zistenie možno zovšeobecniť pre väčšinu kom­plexných skórovacích systémov založených na priamych biomarkeroch alebo kombinácii priamych a nepriamych sérových biomarkerov. Obe skupiny neinvazívnych metód na diagnózu pečeňovej fibrózy majú svoje výhody aj nevýhody (tabuľka 3), ich klinická využiteľnosť závisí vo väčšine krajín od ich dostupnosti a ceny.

Záver

Klinici majú k dispozícii dve neinvazívne alternatívy na identifikáciu závažnej fibrózy alebo cirhózy pečene. Vyšet­renie elasticity pečene najčastejšie pomocou ultrazvukovej TE je rýchle, bezpečné a relatívne dostupné. Sérové biomar­kery sa používajú najmä v rôznych kombináciách na výpo­čet rozhodovacieho skóre alebo cut-off hodnoty, ktorá v da­nom skórovacom systéme slúži na vylúčenie alebo predikciu fibrózy⁽⁴⁾. Dostupnosť dostatočne citlivých a špecifických sé­rových biomarkerov umožňuje skríning a monitorovanie zá­važného ochorenia pečene vo veľkých skupinách pacientov a posúdenie skutočného rozsahu COP v bežnej populácii. Neinvazívne markery pečeňovej fibrózy majú svoje miesto pri určovaní štádia fibrózy u pacientov bez jasnej indikácie biopsie, u pacientov s chronickými hepatitídami vyžadujú­cimi dlhodobé monitorovanie progresie fibrózy, u pacientov s autoimunitnými hepatitídami, ktorí vyžadujú monitorovanie dlhodobej imunosupresívnej liečby. Vývoj nových liečiv pre vybrané typy pečeňových ochorení, napr. chronickej VHC, VHB a NAFLD rovnako zvyšuje potrebu častejšieho posúde­nia fibrózy v rámci monitorovania efektu liečby. Neinvazívne markery môžu byt’ použité aj na monitorovanie antifibrotickej liečby, pretože korelujú s histologickým nálezom pacientov a umožňujú včasnú identifikáciu pacientov, ktorí môžu profi­tovať z dlhodobej liečby. Aj keď v súčasnosti neinvazívne markery nie sú schopné nahradit biopsiu pečene, významnou mierou znižujú jej po­trebu. Vývoj nových špecifických biomarkerov a biomarkerov v kombinácii s novými zobrazovacími a fyzikálnymi metóda­mi môže v budúcnosti navodiť stav, keď použite biopsie pri vyšetreniach pečene bude výnimočné.

LITERATÚRA

1. Negro F. Epidemiology of hepatitis C in Europe. Dig Liv Dis 2014; 46: S158-S164.
2. Blachier M, Leleu H, Peck-Radosavljevic M, et al. The burden of liver disease in Europe: A review of available epidemiological data. J Hepatol 2013; 58: 593-608.
3. Younossi ZM, Koenig AB, Abdelatif B, et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease – Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology 2016; 64: 73-84.
4. European association for the Study of the Liver. EASL-ALEH Clinical practice guidelines: Non-invasive tests for evaluation of liver disease severity and prognosis. J Hepatol 2015; 63: 237-264.
5. Liu T, Wang W, Karsdal MA, et al. Molecular serum markers of liver fibrosis. Biomarker Insights 2012; 7: 105-117.
6. Buzzetti E, Lombari R, De Luca L, et al. Noninvasive assessment of fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Int J Endokrin 2015; 2015: Article ID 343828, 9 pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/343828
7. Fallatah HI. Noninvasive biomrkers of liver fibrosis: An overview. Advances in Hepatology 2014; 2014: Article ID 357287, 15 pages. http:// dx.doi.org/10.1155/2014/357287.
8. Machado MV, Cortez-Pinto H. Non-invasive diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol 2013; 58: 1007-1019.
9. Boursier J, Vergniol J, Guillet A, et al. Diagnostic accuracy and prognostic significance of blood fibrosis tests and liver stiffness measurements by FibroScan in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatology 2016; 65: 570-578.
10. Koller T, Kollerová J, Huorka M, et al. Noninvasive scoring algorithm to identify significant liver fibrosis among treatment-naive chronic hepatitis C patients. Eur J Gastroenterol Hepatol 2014; 10: 1108-1115.
11. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): assessment and management. (júl 2016). Dostupné na Internete: NICE guideline [NG49]: nice.org.uk
12. Guha IN, Parkers J, Chattopadhyay D, et al. Noninvasive markers of fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease: Validation the European Liver Fibrosis Panel and exploring simple markers. Hepatology 2008; 47: 455-460.
13. Kim BK, Kim H-S, Yoo EJ, et al. Risk assessment of clinical outcomes in Asian patients with chronic hepatitis B using enhanced liver fibrosis test. Hepatology 2014; 60: 1911-1919.
14. Tanwar S, Trembling PM, Hogan BJ, et al. Noninvasive markers of liver fibrosis: on-treatment changes od serum markers predict the outcome of antifibrotic therapy. Eur J Gastroenterol Hepato 2017; 29: 289-298.
15. Castera L. Noninvasive methods to assess liver disease in patients with hepatitis. Gastroenterology 2012; 142: 1293-1302.
16. Chindamo MC, Boursier J, Luiz RR, et al. Fibrosis assessment using FibroMeter combined to first generation tests in hepatitis C. W J Hepatol 2017; 28: 310-317.
17. Friedrich-Rust M, Ong M-F, Martens S, et al. Performance of transient elastography for staging of liver fibrosis: Meta-analysis. Gastroenterology 2008; 137: 960-974.
18. Tsochatzis A, Gurusamy K, Burrough A, et al. Elastography for the diagnosis of severity of fibrosis in chronic liver disease: A metaanalysis of diagnostic accuraccy. J Hepatol 2011; 54: 650-659.
19. Huwart L, Salameh N, ter Beek L, et al. MR elastography of liver fibrosis: preliminary results comparing spi-echo and echo-planar imaging. Eur radiology 2008; 18: 2535-2541.
20. Houot M, Ngo Y, Munteanu M, et al. Systemic review with meta­analysis: direct comparisons of biomarkers for diagnosis of fibrosis in chronic hepatitis C and B. Aliment Pharmacol Ther 2016; 43: 16-29.