*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Ph (BCR-ABL1) negatívne myeloproliferatívne neoplázie (MPN) sú podskupinou ochorení hematopoetickej kmeňovej bunky, pre ktoré je charakteristická následná proliferácia erytrocytovej, granulocytovej alebo megakaryocytovej línie a zvýšená tendencia leukemickej transformácie. S hyperproliferáciou kostnej drene koreluje myeloproliferácia v periférnej krvi a/alebo v slezine. Pre Ph-MPN sú typické zložité molekulárne zmeny, ktoré spôsobujú klinicky rôznorodý priebeh ochorenia s nepriaznivým vplyvom na kvalitu a dĺžku života.

Najčastejšie, tzv. klasické Ph-MPN tvorí polycytémia vera (PV), esenciálna trombocytémia (ET) a primárna myelofibróza (PMF). Sú známe arteriálnymi a venóznymi trombózami, cytopéniou, výraznou splenomegáliou a najmä rizikom prechodu do akútnej leukémie. Somatické mutácie vyskytujúce sa vo väčšine týchto MPN, zahŕňajú JAK2 mutáciu, MPL mutáciu a mutáciu v géne pre CALR. Špecifickú skupinu tvoria pacienti, ktorí nevykazujú žiadnu z kľúčových mutácií, na základe čoho sa v literatúre radia k „triple“ negatívnym. Napriek tejto skutočnosti je u nich rovnako ako v prípade MPN pacientov s riadiacimi mutáciami stimulovaná JAK/STAT signálna kaskáda. Vďaka významným objavom týkajúcim sa mutačných zmien a ovplyvnení JAK/STAT dráhy sa v posledných desaťročiach výrazne zlepšila diferenciálna diagnostika a teda aj samotná liečba pacientov s MPN.

Ako výsledok objavenia mutácií v exóne 9 génu pre kalretikulín, je diagnostika na molekulárnej úrovni schopná odhaliť približne 75 – 90 % klonálnych MPN. Zaradenie skríningu CALR mutácií do rutinnej praxe sa stáva esenciálnym z hľadiska diferenciálnej diagnostiky JAK2 negatívnych MPN a prispieva k odhaleniu fenotypových charakteristík spojených s mutáciami typu 1 a typu 2 génu pre CALR.

Diagnostické kritériá MPN

Kritériá pre diagnostiku MPN boli vytvorené a zosumarizované WHO v roku 2016 a rozdelené na veľké „major“ a malé „minor“ kritériá (tabuľka 1). Pre diagnostikovanie PV musia mať pacienti splnené všetky tri body veľkých kritérií alebo prvé dva z veľkých a malé kritérium. Pre ET musia platiť všetky štyri hlavné kritériá alebo prvé tri z hlavných kritérií a malé kritérium. Pre skupinu pacientov s PMF musia byť v platnosti všetky veľké kritériá a minimálne jedno malé kritérium(1) .

Mutácie sprevádzajúce myeloproliferatívne neoplázie

Mutácie sprevádzajúce MPN sa rozdeľujú na kľúčové alebo riadiace (označované v literatúre aj ako „driver“ mutácie) a na prídavné mutácie.

Kľúčové (riadiace) mutácie myeloproliferatívnych neoplázií Kľúčové mutácie sú prítomné vo veľkej väčšine pacientov s klasickou Ph-MPN. Somatické mutácie v jednom z 3 génov, t. j. JAK2 (mutácia v géne pre Janus kinázu 2), MPL (mutácia v géne pre trombopoetínový receptor) a CALR (mutácia v géne pre kalretikulín), sú zodpovedné za špecifický fenotyp ochorenia. Nadmerne aktivovaná signálna dráha JAK/ STAT je spoločnou patogenetickou črtou Ph-MPN, a to aj vrátane „triple“ negatívnych pacientov, u ktorých nie je dokázaná žiadna z uvedených somatických mutácií(2) .

Somatická bodová mutácia JAK2 génu sa predpokladá takmer u všetkých pacientov s PV a v 50 – 60 % pacientov s ET a PMF. Približne 25 % pacientov s ET a 36 % pacientov s PMF má pozitívnu mutáciu v géne pre CALR. Mutácia v géne MPL bola zistená v 4 % pacientov s ET a v 6 % pacientov s PMF, zatiaľ čo „triple“ negatívnych pacientov je asi 5 % pri diagnózach PV a PMF a 12 % pri ET (obrázok 1)(3) .

JAK2 (Janus kináza 2) Janus kinázy (JAK) patria do rodiny nereceptorových tyrozínkináz, ktoré asociujú so širokou škálou cytokínových receptorov zahrnutých v bunkovom raste, hematopoéze a imunitnej odpovedi. Za fyziologických podmienok, t. j. za stavu, keď nie je prítomná mutácia, JAK kináza asociuje s receptorovými monomérmi, ktoré po naviazaní ligandu dimerizujú a vedú k fosforylácii a aktivácii JAK kináz. Tie následne fosforylujú špecifické tyrozínové zvyšky cytokínových receptorov, čo má za následok fosforyláciu ďalších signálnych molekúl vrátane STAT (signálny transduktor a aktivátor transkripcie), fosfatidylinozitol-3-kinázy (PI3K), proteínkinázy B (známej tiež ako AKT) a MAPK (proteínkináza aktivovaná mitogénom)(4) . JAK2 kináza je zapojená do signálnej dráhy receptorov hematopoetických rastových faktorov, ako je napr. trombopoetínový receptor, receptor pre erytropoetín a mnohé ďalšie. Tyrozínkináza JAK2 je aktivovaná celou škálou špecifických cytokínov a pôsobí ako aktivátor JAK/STAT signálnej dráhy, ktorá následne reguluje bunkovú proliferáciu a diferenciáciu najmä hematopoetických a imunitných buniek(5) .

V patogenéze myeloproliferatívnych neoplázií sa najčastejšie vyskytuje somatická mutácia JAK2 génu vedúca k zámene bázy G za T na nukleotide 1849 v exóne 14 pseudokinázovej domény JH2, čo predstavuje zámenu aminokyseliny valín za fenylalanín v kodóne 617 (JAK2V617F )(6,7) . Mutácia vedie ku konštitutívnej aktivácii JAK2 s následnou hypersenzitivitou na cytokíny a k aktivácii cytokínových receptorov nezávisle od väzby ligandu, a teda k nekontrolovanej hematopoetickej transformácii a proliferácii(6) . Na báze mutácie JAK2 V617F a deregulácie JAK/STAT kaskády je objasnených približne 60 % BCR-ABL negatívnych MPN(7) . Frekvencia homozygotných mutácií JAK2 varíruje medzi 25 – 30 % v prípade PV a PMF, zatiaľ čo pri ET je zastúpenie homozygotných mutácií raritné a predstavuje približne 2-4 % všetkých prípadov ET. Prítomnosť homozygotných mutácií pri PV a ET je asociovaná s vyšším rizikom progresie do myelofibrózy(8) .

MPL Napriek tomu, že v myeloproliferatívnych neopláziách dominuje mutácia JAK2V617F , s nižšou frekvenciou sa vyskytujú aj mutácie iných génov spriahnutých s myeloproliferáciami. Jednou z nich je mutácia v géne MPL, ktorý kóduje trombopoetínový receptor (MPL) viažuci na seba trombopoetín (TPO). Ich väzba vedie k homodimerizácii receptora, aktivácii JAK2, fosforylácii MPL a stimulácii signalizačnej kaskády JAK/STAT, regulujúcej proliferáciu a diferenciáciu buniek(9) .

Doposiaľ bolo identifikovaných viacero mutácií MPL génu, pričom dve najčastejšie, t. j. mutácia v kodóne 515, označovaná ako MPL W515L (zámena tryptofánu za leucín) a MPLW515K (zámena tryptofánu za lyzín), sa vyskytujú v exóne 10. Výsledným efektom MPL mutácií je aktivácia trombopoetínového receptora bez prítomnosti ligandu. Výsledkom je mobilizácia tyrozínkináz a stimulácia JAK/STAT signálnej cesty(10) . Mutácie sú väčšinou v heterozygotnom stave, homozygotný stav sa spája s progresiou ochorenia a fibrózou kostnej drene(11) .

Prítomnosť MPL mutácií súvisí s ET a PMF, preto sa diagnostika daných mutácií odporúča u pacientov s negatívnou mutáciou JAK2V617F . V raritných prípadoch bola preukázaná prítomnosť oboch typov, t. j. MPL i JAK2 V617F mutácií(12) .

Kalretikulín V roku 2013 bol identifikovaný gén kódujúci kalretikulín (CALR), ktorého mutácie boli zistené u pacientov s myeloproliferatívnymi neopláziami, vykazujúcich JAK2 negativitu, v 25 % u pacientov s ET a v 36 % s PMF(13,14) . V súčasnosti je známych približne 50 typov mutácií CALR, hoci až 80 % zo všetkých predstavujú dve najčastejšie, t. j. delécia 52bp (del52; c.1092_ 1143del; L367fs*46) a inzercia 5bp (ins5; c.1154_1155insTTGTC; K385fs*47), označované aj ako typ 1 a typ 2.

Predpokladá sa, že mutácie CALR zohrávajú kľúčovú úlohu vo vývoji MPN aktiváciou MPL cez JAK/STAT signálnu cestu(15) . Mutácie CALR typu 1 sa vyskytujú častejšie v PMF a sú spojené s priaznivejšou prognózou, predĺženým celkovým prežívaním v porovnaní s inými formami PMF, pri ktorých nie je prítomná mutácia CALR. Naopak, mutácie typu 2 sú viac zastúpené pri ET a fenotypovo sú porovnateľné s JAK2 V617F mutáciou(16) . Pacienti s ET a mutáciou CALR typu 2 majú vyššie množstvo trombocytov. Riziko progresie ET do myelofibrózy je zvýšené pri mutáciách typu 1(16) .

Prídavné mutácie myeloproliferatívnych neoplázií Ako prídavné mutácie sa označujú tie, ktoré nespadajú do kategórie kľúčových mutácií sprevádzajúcich ochorenie MPN, teda mutácie iné než v génoch JAK2, MPL alebo CALR(17) . Mutácie boli roztriedené do kategórií podľa ich hlavnej funkcie, t. j. na modifikátory chromatínu, komponenty spliceozómového komplexu, modifikátory DNA metylácie, tumorsupresory a regulátory transkripcie. Tieto mutácie majú jednoznačne patogénny charakter, zapájajú sa do progresie ochorenia, leukemickej transformácie, vo zvýšenej miere sú exprimované v blastovej fáze MPN a negatívne ovplyvňujú prežívanie pacientov s MPN(18) . Frekvencia a zastúpenie mutácií sú znázornené v tabuľke 2.

Záver

Vďaka objavom mutačných zmien a ovplyvneniu JAK/ STAT signálnej cesty v poslednom desaťročí nastal výrazný pokrok v poznaní patofyziológie a diagnostiky MPN. Hoci v súčasnosti existujú možnosti liečby, ktoré sú schopné do určitej miery kontrolovať priebeh ochorenia, stále absentuje „game changer“, ktorý by bol schopný eliminovať ochorenie u väčšiny pacientov. Leukemická transformácia zostáva naďalej hlavnou komplikáciou MPN. Hoci na jednej strane dokážeme identifikovať riziká transformácie, na strane druhej stále nedokážeme zabrániť prechodu do akútnej leukémie v špecifickej skupine pacientov s MPN. Diferenciálna diagnostika podtypov MPN je kľúčová pre správny monitoring pacientov a znamená úzku spoluprácu klinikov, genetikov a patológov. Pohľad na klinický priebeh ochorenia je významný aj vzhľadom na manažment špeciálnych situácií, ako je predkoncepčná starostlivosť, gravidita či predoperačná starostlivosť.

Poďakovanie Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Dlhodobý strategický výskum a vývoj zameraný na výskyt Lynchovho syndrómu v populácii SR a možnosti prevencie nádorov spojených s týmto syndrómom, kód ITMS: 313011V578, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

LITERATÚRA

1. Loscocco GG, Guglielmelli P, Vannucchi AM. Impact of Mutational Profile on the Management of Myeloproliferative Neoplasms: A Short Review of the Emerging Data. Onco Targets Ther. 2020; 13: 12367-12382.
2. Rampal R, Ahn J, Abdel-Wahab O, et al. Genomic and functional analysis of leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms. Proc Natl Acad Sci. 2014; 111: E5401-5410
3. Prins D, Arias CG, Klampfl T, et al. Mutant Calreticulin in the Myeloproliferative Neoplasms. Hemasphere. 2020; 4: e333
4. Sandberg EM, Wallace TA, Godeny MD, et al. JAK2 tyrosine kinase: a true jak of all trades? Cell Biochem Biophys. 2004; 41: 207-232
5. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell. 2005; 7: 387-397
6. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet. 2005; 365: 1054-1061
7. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med. 2005; 352: 1779-1790
8. Vannucchi AM, Antonioli E, Guglielmelli P, et al. Clinical profile of homozygous JAK2 617 V>F mutation in patients with polycythemia vera or essential thrombocythemia. Blood. 2007; 110:840-846
9. Vainchenker W, Kralovics R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 2017; 129: 667679
10. Arunachalam AK, Suresh H, Mathews V, et al. Allele specific PCR: a cost effective screening method for MPL mutations in myeloproliferative neoplasms. Indian J Hematol Blood Transfus. 2018; 1543-1545
11. Rumi E, Pietra D, Guglielmelli P, et al. Acquired copy-neutral loss of heterozygosity of chromosome 1p as a molecular event associated with marrow fibrosis in MPL-mutated myeloproliferative neoplasms. Blood. 2013; 121: 4388-4395
12. Furtado LV, Weigelin HC, Elenitoba-Johnson SJ, et al. Detection of MPL mutations by a novel allele-specific PCR-based strategy. J Mol Diagn. 2013; 15: 810-818
13. Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 2013; 369: 2379-2390
14. Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 2013; 2391-2405
15. Araki M, Yang Y, Masubuchi N, et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016; 127: 1307-1316
16. Pietra D, Rumi E, Ferretti VV, et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 2016; 30: 431-438
17. Lundberg P, Karow A, Nienhold R, et al. Clonal evolution and clinical correlates of somatic mutations in myeloproliferative neoplasms. Blood. 2014; 123: 2220-2228
18. Chen E, Schneider RK, Breyfogle LJ, et al. Distinct effects of concomitant Jak2V617F expression and Tet2 loss in mice promote disease progression in myeloproliferative neoplasms. Blood. 2015; 125: 327-335
19. Grabek J, Straube J, Bywater M, et al. The Molecular Drivers of Disease Initiation, Progression and Transformation and their Effect on Treatment. Cells. 2020; 9: 1901