*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Molekulárna diagnostika zriedkavých vrodených ochorení sa každý rok zlepšuje, k čomu najmä posledné desaťročie prispievajú techniky sekvenovania novej generácie (NGS, next generation sequencing). Napriek tomu efektivita alebo tzv. diagnostický účinok dosahuje celkovo pri mnohých vrodených ochoreniach aj s využitím NGS asi len 25 %(1). Vrodené poruchy imunity sú skupinou ochorení, kde sa NGS vzhľadom na genetickú variabilitu využíva často. Do tejto skupiny ochorení patrí i vrodená neutropénia, ktorá je charakterizovaná redukciou absolútneho počtu neutrofilov (ANC, absolute neutrophil count) v periférnej krvi, ktorú radíme k poruchám fagocytov. Neutropénia je často klinicky asymptomatická až do momentu, keď sa u pacienta začne prejavovať rekurentnými infekciami, ktoré mnohokrát vedú k chronickým, závažným až život ohrozujúcim stavom(2).

Vrodená neutropénia

Neutropénia je relatívne častým nálezom u približne 1 % populácie, pričom v niektorých populáciách môže jej výskyt dosahovať až 8 %. Vrodená forma neutropénie sa vyskytuje u menej ako 1/100 000 ľudí, čo tvorí približne 1 z 1 000 prípadov všetkých neutropénií(3). Z analýzy dát zozbieraných Medzinárodným registrom závažných chronických neutropénií (SCNIR, Severe Chronic Neutropenia International Registry) sa prevalencia vrodenej a idiopatickej neutropénie pohybovala v štátoch prispievajúcich do registra v rozmedzí od 0,006 až po 8,5 prípadu na milión obyvateľov s priemerom 1,65. Slovensko v tom čase do registra neprispievalo i keď v súčasnosti je partnerom tejto organizácie(3). Monogénová kongenitálna neutropénia predstavuje klinicky a geneticky veľmi heterogénnu skupinu, pričom toto označenie sa vzťahuje na chronickú závažnú neutropéniu bez iných abnormalít, tzv. izolovanú, nesyndrómovú neutropéniu, ako aj na syndrómové genetické ochorenia spojené s rôznymi extrahematologickými fenotypovými prejavmi(4). Neutropénia sa zároveň môže vyskytovať pri iných ochoreniach imunitného systému postihujúcich napríklad získanú imunitu ako ich pridružený prejav alebo ako súčasť klinického obrazu zlyhania kostnej drene(5).

Genetika vrodenej neutropénie

Závažná kongenitálna neutropénia (SCN, severe congenital neutropenia) sa prejavuje ako chronické alebo intermitentné ochorenie, pričom pacienti, ktorí ňou trpia, majú zároveň sklon k rozvoju akútnej myeloidnej leukémie (AML) a myelodysplázie (MDS)(6). S izolovanou formou ochorenia je doposiaľ spojených viacero génov (tabuľka 1), z ktorých najvýznamnejší je gén ELANE, ktorého mutácie sú zodpovedné približne až za 40 % prípadov ťažkej vrodenej neutropénie (obrázok 1) a vyše 50 % prípadov cyklickej neutropénie charakterizovanej osciláciou počtu neutrofilov zvyčajne v 21-dňových cykloch(7). V súčasnosti je známych takmer 200 rôznych mutácií v tomto géne(8) a každý rok pribúdajú nové varianty vrátane variantov vo forme mozaiky(9). Ďalším z asociovaných génov je HAX1, ktorého mutácie spôsobujú vznik autozomálne recesívnej formy SCN, nazývanej aj Kostmannov syndróm, ktorý bol prvýkrát zaznamenaný u švédskej konsangvinačnej rodiny(10). Aj keď je výskyt zriedkavého Kostmannovho syndrómu častejší u pacientov z konsangvinačných rodín, nie je na ne obmedzený a jeho incidencia je vzhľadom na autozomálne recesívny charakter a rôznu frekvenciu HAX1 mutácií geograficky a etnicky závislá. V populáciách s vyššou mierou konsangvinačných manželstiev môžu byť HAX1 varianty zodpovedné dokonca za viac SCN prípadov ako ELANE. Mutácie v iných génoch sú vo vzťahu k vzniku izolovanej kongenitálnej neutropénie identifikované vo výrazne menšej miere (obrázok 1). Navyše gény, ktorých varianty spôsobujú rôzne mierne alebo adultné formy ochorenia, ako je napríklad adultná neutropénia s monocytózou(11), znižujú záchytnosť samotného ochorenia a tým aj možnosť identifikácie molekulárnej príčiny.

Syndrómové neutropénie sú ochorenia spojené s poruchami metabolizmu, vezikulového transportu, imunologických funkcií či s ribozómovou dysfunkciou, ktorých spoločným prejavom je neutropénia(12). Ide o monogénovo podmienené syndrómy s rôznym typom dedičnosti a ich vznik je spájaný s variantmi vo viac ako 30 rôznych génoch (tabuľka 1). Najčastejšie sa vyskytujúcou syndrómovou neutropéniou je Shwachmanov-Diamondov syndróm (SDS), multiorgánové ochorenie spôsobené variantmi v géne SBDS. Varianty v tomto géne sú zároveň po mutáciách v géne ELANE druhou najčastejšou príčinou závažnej kongenitálnej neutropénie (izolovanej i syndrómovej) a sú zodpovedné za 14 % ťažkých vrodených neutropénií (obrázok 1)(13). Vznik závažnej vrodenej neutropénie je výrazne spájaný aj s variantmi v géne SLC37A4 spôsobujúcimi vznik glykogenózy(14), variantmi v TAZ spôsobujúcimi vznik Barthovho syndrómu či variantmi v géne CXCR4I asociovanými so vznikom syndrómu WHIM. Ostatné syndrómové poruchy s prejavmi SCN sú menej časté a predstavujú len malú časť vrodených neutropénií(13). Rovnako je to pri neutropéniách pozorovaných pri iných imunodeficienciách, ktoré spoločne so zlyhaniami kostnej drene, ako je Fanconiho anémia či Dyskeratosis congenita(15), prispievajú k celkovému počtu neutropénií iba minimálne. Aj keď je doposiaľ známych viac ako 50 génov asociovaných so vznikom niektorej z foriem SCN, pre väčšinu platí, že ich mutácie sú veľmi zriedkavé(5).

Molekulárna diagnostika

Genetické testovanie s identifikáciou kauzálneho variantu by malo byť štandardnou stratégiou u pacientov s neutropéniou, keďže identifikácia génu môže napríklad predikovať reakciu na terapiu faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov (G-CSF) aj identifikovať pacientov s rizikom zlyhania kostnej drene, predispozíciou na vznik AML, MDS alebo vzácnej akútnej lymfoblastickej leukémie(6). Molekulárna diagnostika je čoraz dôležitejšia aj vzhľadom na rýchle napredovanie prístupov génovej terapie, a to obzvlášť pri ochoreniach imunitného systému. Wiskottov-Aldrichov syndróm je jedno z ochorení, kde je génová terapia už v štádiu klinického testovania a úspešne bola podaná viacerým pacientom(16).

Identifikácia kauzálneho génového variantu zodpovedného za vznik neutropénie je komplexný proces, kde prvotné zhodnotenie leží na klinickej diagnostike, pri ktorej je potrebné vylúčenie získanej formy ochorenia. Prístup Sangerovho sekvenovania je využiteľný v prípade izolovanej alebo cyklickej neutropénie, pri ktorej je predpoklad prítomnosti variantov v géne ELANE (13). V prípade potvrdenej cyklickej formy SCN je kandidátnym génom GFI1(11), sekvenovanie kandidátneho génu HAX1 je možné najmä v prípade konsangvinity rodičov. Ak je neutropénia súčasťou syndrómu, identifikácia príčiny sa často opiera o ostatné symptómy, ktoré sú typické pre dané ochorenie. Ani prítomnosť extrahematologických znakov však nemusí vždy jednoznačne ukazovať na konkrétny syndróm a rozsiahle testovanie viacerých génov Sangerovým sekvenovaním je časovo a finančne neefektívne, pričom pacient často zostáva bez genetickej diagnózy. Aj z nášho pozorovania môžeme povedať, že priame sekvenovanie je účinné len u pacientov s mutáciou v géne ELANE. Dokonca ani u pacientov s fenotypom špecifického syndrómu, napríklad klinicky diagnostikovaným Shwachmanovým-Diamondovým syndrómom, často nedochádza k identifikácii molekulárnej príčiny ochorenia. Pomocou Sangerovho sekvenovania zároveň nemožno odhaliť variácie počtu kópií (CNV, copy number variant) a delécie na úrovni exónov či celého génu.

Panel, exóm či genóm?

Sangerovo sekvenovanie je pri takýchto geneticky rôznorodých ochoreniach neúčinné a v diagnostickom procese sa čoraz častejšie pristupuje k technikám masívneho paralelného sekvenovania novej generácie vo forme génových panelov, celoexómového (WES, whole exome sequencing) alebo celogenómového (WGS, whole genome sequencing) sekvenovania. Génové panely sa zameriavajú na známe gény spájané so vznikom izolovanej a syndrómovej SCN aj na gény asociované so vznikom AML a MDS(13). V porovnaní s WES alebo WGS prístupmi panelové testovanie redukuje náhodné nálezy, poskytujú lepšie pokrytie a výhodou je i ľahšia interpretácia výsledkov a nižšia cena(17). Na druhej strane panely génov vyžadujú častú aktualizáciu vzhľadom na neustále pribúdajúce poznatky o nových kauzálnych génoch. Len za posledné štyri roky bolo vďaka NGS prístupom identifikovaných viacero nových génov (EFL1, HYOU1, SRP54, SMAR- CD2) asociovaných so vznikom SCN a môžeme predpokladať, že ich počet bude narastať aj v budúcnosti(4,18). Väčšina komerčne dostupných panelov neposkytuje sekvenovanie viac ako 30 génov (Invitae Corporation, PreventionGenetics, Blueprint Genetics Oy., Fulgent Genetics a iné), a preto cielené sekvenovanie nemusí odhaliť príčinu ochorenia až u 40 % pacientov(4), pričom toto číslo môže byť vyššie v prípade, že panelové sekvenovanie sa vykoná len u ELANE negatívnych pacientov. V súčasnosti však chýba dostatok štúdií, ktoré by porovnávali diagnostickú účinnosť panelového sekvenovania a jednotlivých panelov u pacientov s neutropéniou.

Z hľadiska identifikácie kauzálneho variantu, ako aj identifikácie nových génov asociovaných s SCN je najlepšou voľbou prístup WES alebo WGS. Tie sa v súčasnosti využívajú najmä na výskumné účely, ale postupne si hľadajú cestu aj do bežného diagnostického procesu. V diagnostike vrodených porúch imunity môžu dané prístupy dosahovať diagnostickú účinnosť od 10 až po takmer 90 %(19,20). WGS poskytuje uniformné pokrytie genómu so všetkými kódujúcimi i regulačnými sekvenciami, intragénovými regiónmi aj identifikáciu CNV, ale za vyššiu cenu a celkovo zvýšenú náročnosť analýzy. WES predstavuje akýsi kompromis medzi panelovým sekvenovaním a WGS a jeho použitie na začiatku diagnostického procesu môže strojnásobiť počet pacientov s molekulárnou diagnózou za tretinu celkových nákladov(21). WES však nemusí zabezpečiť postačujúce pokrytie všetkých požadovaných sekvencií a interpretácia jednotlivých detegovaných variantov, najmä variantov neistej signifikancie, je v súčasnosti stále výzvou. Interpretáciu variantov získaných pomocou NGS výrazne zjednodušuje trio sekvenovanie probanda a oboch rodičov, najčastejšie vo forme WES, ktoré umožňuje sledovať dedičnosť variantov od bezpríznakových rodičov a najmä vznik de novo variantov(15). Trio sekvenovanie však značne zvyšuje cenu diagnostického procesu. Na zhodnotenie efektivity jednotlivých prístupov v molekulárnej diagnostike neutropénie v súčasnosti nie je dostatok štúdií, čo je spôsobené nízkou incidenciou ochorenia a teda malým počtom pacientov. Dôležité však je ku každému pacientovi pri- stupovať individuálne, a zároveň tak, aby bola zachovaná vysoká diagnostická účinnosť pri súčasne efektívne využitých zdrojoch.

Poďakovanie

Práca bola finančne podporená Vedeckou grantovou agentúrou Ministerstva školstva, vedy, výskumu a športu Slovenskej republiky a Slovenskej akadémie vied (VEGA 1/0190/19) a Ministerstvom zdravotníctva Slovenskej republiky (MZSR_2018/46-SAV-5).

LITERATÚRA

1. Hartman P, Beckman K, Silverstein K, et Next generation sequencing for clinical diagnostics: Five year experience of an academic laboratory. Mol Genet Metab Reports. 2019;19:100464.
2. Arceci RJ, Hann IM, Smith OP, et Pediatric Hematology. Blackwell Publishing Ltd; 2006.
3. Donadieu J,  Beaupain  B,  Mahlaoui  N,  Bellanné-Chantelot  C.  Epidemiology of Congenital Neutropenia. Hematol Oncol Clin North Am. 2013;27(1):1-17.
4. Donadieu J, Beaupain B, Fenneteau O, Bellanné-Chantelot Congenital neutropenia in the era of genomics: classification, diagnosis, and natural history. Br J Haematol. 2017;179(4):557-574.
5. Tangye SG, Al-Herz W, Bousfiha A, et Human Inborn Errors of Immunity: 2019 Update on the Classification from the International Union of Immunological Societies Expert Committee. J Clin Immunol. 2020;40(1):24- 64.
6. Mehta HM, Malandra M, Corey G-CSF and GM-CSF in Neutropenia. J Immunol. 2015;195(4):1341-1349.

7. Dale DC, Bolyard AA, Aprikyan Cyclic neutropenia. Semin Hematol. 2002;39(2):89-94.

8. Germeshausen M, Deerberg S, Peter Y, Reimer C, Kratz CP, Ballmaier M. The Spectrum of ELANE Mutations and their Implications in Severe Congenital and Cyclic Hum Mutat. 2013;34(6):905-914.
9. Liu Q, Zhang L, Shu Z, et al. Two paternal mosaicism of mutation in ELANE causing severe congenital neutropenia exhibit normal neutrophil morphology and ROS Clin Immunol. 2019;203:53-58.
10. Kostmann Infantile Genetic Agranulocytosis (Agranulocytosis infantilis hereditaria) A New Recessive Lethal Disease in Man. Acta Paedi- atr. 1956;45(3):309-310.
11. Armistead PM, Wieder E, Akande O, et correspondence: Cyclic neutropenia associated with T cell immunity to granulocyte proteases and a double de novo mutation in GFI1, a transcriptional regulator of ELANE. Br J Haematol. 2010;150(6):716-719.
12. Boxer LA, Newburger PE. A molecular classification of congenital neutropenia Pediatr Blood Cancer. 2007;49(5):609-614.
13. Skokowa J, Dale DC, Touw IP, et Severe congenital neutropenias. Nat Rev Dis Prim. 2017;3:17032.
14. Chou JY, Jun HS, Mansfield B Type I glycogen storage diseases: disorders of the glucose-6-phosphatase/glucose-6-phosphate transporter complexes. J Inherit Metab Dis. 2015;38(3):511-519.
15. Furutani E, Newburger PE, Shimamura Neutropenia in the age of genetic testing: Advances and challenges. Am J Hematol. 2019;94(3):384- 393.
16. Ferrua F, Marangoni F, Aiuti A, et Paradigms and perspectives Gene therapy for Wiskott-Aldrich syndrome: History, new vectors, future directions. J Allergy Clin Immunol. 2020;146:262-265.
17. Bean LJH, Funke B, Carlston CM, et al. Diagnostic gene sequencing panels: from design to report—a technical standard of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2020;22(3):453-461.
18. Carapito R, Konantz M, Paillard C, et al. Mutations in signal recognition particle SRP54 cause syndromic neutropenia with Shwachman-Diamond-like J Clin Invest. 2017;127(11):4090-4103.
19. Al-Herz W, Chou J, Delmonte OM, et Comprehensive genetic results for primary immunodeficiency disorders in a highly consanguineous population. Front Immunol. 2019;10(JAN):3146.
20. Chinn IK, Orange JS. A 2020 update on the use of genetic testing for patients with primary immunodeficiency. Expert Rev Clin Immunol. 2020;16(9):897-909.
21. Stark Z, Schofield D, Alam K, et al. Prospective comparison of the cost-effectiveness of clinical whole-exome sequencing with that of usual care overwhelmingly supports early use and reimbursement. Genet Med. 2017;19(8):867-874.