*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom 
PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Základné biochemické a cytologické  vyšetrenie likvoru tvorí základ štandardnej diagnostiky akútnych ochorení postihujúcich  nervový systém, pretože poskytuje cenné vstupné informácie o možnom charaktere ochorenia. Využitím vysokocitlivých imunochemických metód môžeme následne špecifikovať príslušné patologické procesy. Keďže likvor je ultrafiltrát plazmy, mnohé analyty sa paralelne stanovujú v likvore aj v krvi a následne sa hodnotia vzhľadom na priepustnosť hematolikvorovej bariéry. Odber likvoru z diagnostických  i terapeutických dôvodov sa najčastejšie vykonáva lumbálnou punkciou (LP).

Indikácie vyšetrenia likvoru:

1. Zápalové ochorenia nervového systému

• akútne neuroinfekcie (hnisavé, serózne)
• zápaly autoimunitného pôvodu
  CNS: sclerosis multiplex (SM), neuromyelitis optica, akútna demyelinizujúca encefalomyelitída,
  PNS: GBS, AIDP, CIDP a varianty
• systémové autoimunitné ochorenia postihujúce nervový systém (vaskulitídy, SLE a iné)

2. Subarachnoidálne krvácanie

3. Nádorové postihnutie CNS

• malígna meningeálna  infiltrácia (karcinomatózna, leukemická)
• paraneoplastické likvorové syndrómy

4. Neurodegeneratívne ochorenia

• Creutzfeldova-Jacobova choroba, Alzheimerova choroba, amyotrofická laterálna skleróza, Parkinsonova choroba

5. Likvorea

Základná likvorológia

Bielkoviny v likvore (proteinorachia)

Asi 80 % bielkovín v likvore pochádza z periférnej krvi, zvyšných 20 % vzniká intratekálne v mozgovom parenchýme a leptomeningoch.  Hyperproteinorachia  je patologický jav, ktorý vzniká ako dôsledok:

• zvýšenej priepustnosti hematolikvorovej bariéry
• intratekálnej syntézy proteínov
• poruchy cirkulácie likvoru

Glukóza v likvore (glykorachia)

Glukóza je hlavný energetický substrát mozgového tkaniva. Prostredníctvom transportných systémov v plexus chorioideus je z  periférnej krvi transportovaná do  mozgu.  A si 60  –  70  % koncentrácie glukózy v likvore (odobratého LP) pochádza z periférnej krvi. Glykorachia  je preto určená kapacitou týchto prenášačových systémov,  využitím glukózy v mozgu a jej reabsorpciou v likvore.

Patologické hodnoty:

Hyperglykorachia – pri hyperglykémii (napríklad diabetici) Hypoglykorachia – bakteriálne meningitídy, nádorové ochorenia postihujúce CNS, ischémie mozgu, SAK.

Laktát v likvore:

Laktát vzniká priamo  v mozgových  bunkách pri glykolýze za anaeróbnych podmienok. Na rozdiel od glukózy jeho koncentrácia v likvore nezávisí od koncentrácie v plazme. Laktát spolu s glukózou sú hlavnými markermi na rozlíšenie hnisavej meningitídy od nehnisavej.

Patologické hodnoty:

Zvýšená koncentrácia laktátu

• bakteriálne meningitídy
• CMP (spojená s ťažkou hypoxiou mozgu)
• SAK
• malígna infiltrácia mozgových  obalov
• metabolické ochorenia postihujúce CNS (napríklad mitochondriálna encefalomyopatia)

Cytológia likvoru

Cytologický nález umožňuje odhaliť neoplastický proces v intratekálnom priestore alebo potvrdiť subarachnoidálne krvácanie v prípadoch, keď zobrazovacie metódy zlyhali (negatívny nález CT). Prednosťou kvalitatívnej cytológie je možnosť  pozorovať v jednom obraze dve štádiá krvácania naraz (čerstvé a staré krvácanie). Kvantitatívna cytológia sa hodnotí vo Fuchsovej-Rosenthalovej komôrke. Stanoví sa počet mononukleárov, polynukleárov a erytrocytov. Fyziologický nález je do 10 buniek/3 µl, u novorodencov do 90 buniek/3 µl. Prítomnosť  patologických  buniek pri fyziologickom  počte buniek sa označuje  ako patologická  oligocytóza  (tabuľka 1). Pri zvýšenom  počte buniek v likvore hovoríme o pleiocytóze (tabuľka 2).

Zhodnotenie morfológie buniek (kvalitatívny cytologický náter) je súčasťou  každej cytológie  likvoru. Význam  má najmä pri nádorových ochoreniach postihujúcich nervový systém, pretože pri stanovení počtu buniek komôrkovou metódou nádorové bunky mnohokrát nie je možné zachytiť, respektíve nie je možné ich správne identifikovať. Za fyziologických podmienok sa v likvore nachádzajú mononukleáry, t. j. lymfocyty  (fyziologicky  do 10 % v aktivovanom stave) a monocyty (v pokoji) v pomere 7/3, ojedinele  aj bunky výstelky likvorových ciest. U novorodencov sú okrem mononukleárov v likvore prítomné  aj neutrofilné granulocyty (ich prítomnosť súvisí s nezrelosťou mozgových bariér).

Zastúpenie buniek v likvore za patologických podmienok:

• aktivované lymfocyty (nad 10 %)
• plazmatické bunky
• aktivované monocyty
• granulogyty  (neutrofily, eozinofily, bazofily)
• erytrocyty
• makrofágy s príslušným substrátom:
  erytrofág (čerstvé krvácanie) (obrázok 3) siderofág (staršie krvácanie)
  siderofág s kryštálom hematoidínu  (staršie krvácanie)
  leukofág (hnisavé zápaly)
  lymfofág (vírusové zápaly,sclerosis multiplex) (obrázok 4)
  lipofág (deštrukcia tkaniva CNS)
  mykofág (mykotické ochorenia CNS)
• malígne bunky pri primárnych nádoroch  (nádorový proces  v CNS alebo v blízkosti likvorových ciest) alebo pri sekundárnych tumoroch (CA prsníka (obrázok 5), Ca hrubého čreva, CA pľúc, melanóm) a he- matoonkologických ochoreniach (leukémie, lymfómy (obrázok 6))

Špeciálna likvorológia

Hematolikvorová bariéra (HLB) zabezpečuje  komunikáciu medzi krvným systémom  a likvorom. Dominantným  transportným mechanizmom  v plexus chorioideus  je difúzia. Proteíny prechádzajú  z krvi do likvoru aj pinocytózou  alebo špecifickými prenášačmi. Sledovanie permeability HLB tvorí základ monitorovania biochemických  a imunologických procesov prebiehajúcich pri mnohých neurologických ochoreniach (tabuľka 3).

Albumínový kvocient – Q (Alb) je marker na posúdenie selektivity HLB. Hodnoty albuminorachie a albumínového kvocientu sú nielen mierou priepustnosti bariéry, ale upozorňujú  aj na zápal, možnú prekážku v likvorových cestách (najmä v miechovom kanále) alebo na závažný metabolický rozvrat (napríklad porucha acidobázickej rovnováhy).

Do likvoru sa albumín  dostáva  výlučne  len z periférnej krvi, a to procesom ultrafiltrácie krvnej plazmy cez plexus chorioideus. Patologické stavy narúšajúce regulačné mechanizmy HLB spôsobujú zvýšenú koncentráciu albumínu v likvore. Albumínový  kvocient je daný pomerom: Q(Alb) = (CSF – Alb/S – Alb) x 10-3.

Humorálna imunita v CNS

Aj za fyziologických podmienok v CNS nachádzame  protilátky, ktoré pochádzajú zo systémovej cirkulácie. Pri zápalových procesoch, v dôsledku intratekálnej syntézy, dochádza k zvýšeniu ich koncentrácie v likvore. Táto syntéza protilátok v CNS pochádza z perivaskulárnych infiltrátov B-lymfocytov, ktoré tu lokálne proliferujú na plazmatické bunky a následne produkujú príslušné protilátky. Humorálna imunitná odpoveď v CNS je odlišná od imunitnej odpovede v krvi. Charakteristická  tvorba protilátok vo všetkých triedach IgG/ IgM/IgA  je v CNS prítomná na začiatku ochorenia  a následne zostáva relatívne konštantná. Dĺžka trvania intratekálnej produkcie protilátok závisí od pôvodcu ochorenia, lokalizácie daného procesu a patofyziologických mechanizmov  ochorenia (tabuľka 4).

Možné príčiny intratekálnej humorálnej odpovede:

• akútne zápalové ochorenie  v CNS so špecifickou odpoveďou na infekčný agens (vírusy, baktérie, parazity)
• zostatková intratekálna syntéza protilátok po prekonaní infekcie (pokles syntézy protilátok bez klinických symptómov)
• chronický zápalový proces autoimunitného charakteru (polyšpecifická protilátková odpoveď bez dôkazu vyvolávajúceho antigénu)

Možnosti dôkazu intratekálnej oligoklonovej produkcie protilátok:

• výpočtom podľa Reibera, Linka (tzv. IgG index), ide o odhad intratekálnej tvorby protilátok
• izoelektrická fokusácia (IEF) považovaná za zlatý štandard

Detekcia intratekálnej oligoklonovej produkcie  protilátok IgG v likvore má veľkú výpovednú  hodnotu pri diagnostikovaní zápalových demyelinizačných ochorení CNS ako sclerosis multiplex, pri možných autoimunitných ochoreniach postihujúcich CNS, pri paraneoplastických ochoreniach,  pri seróznych  neuroinfekciách  i pri postinfekčných demyelinizačných  encefalitídach  (prekonanie nešpecifickej vírusovej infekcie, reakcia po očkovaní) – tabuľka 5. Pri postinfekčných demyelinizáciách pozície oligoklonových IgG gradientov (pohyblivosť prevažne v neutrálnej a kyslej oblasti pH-gradientu) po určitom čase vymiznú. Pri klinicky definitívnej  sclerosis  multiplex  sú pozície oligoklonových IgG nemenné  (pohyblivosť v alkalickej oblasti pH-gradientu). S časom môžu len pribúdať ďalšie gradienty, poprípade sa mení intenzita oligoklonových IgG gradientov (1, 5).

Intratekálna syntéza špecifických protilátok v likvore

Protilátkový index (AI, antibody index) predstavuje určitú intratekálne syntetizovanú frakciu špecifických protilátok v likvore. Je daný pomerom kvocientu  príslušnej špecifickej protilátky QšpecIg a kvocientu celkového príslušného imunoglobulínu QIg.

Interpretácia patologickej hodnoty AI ≥ 1,5:

• dôkaz intratekálnej syntézy protilátok proti etiologickému  antigénu
• dôkaz sekundárnej polyšpecifickej imunitnej reakcie bez prítomnosti daného antigénu alebo bez klinických príznakov príslušnej infekcie Oligoklonalita IgG je výsledkom polyšpecifickej imunitnej odpovede s množstvom protilátok. Tieto protilátky sú namierené proti rôznym antigénom ako vírusy, baktérie, vlastné autoantigény neurónov alebo oligodendrocytov a iné (tabuľka 6).

MRZ-reakcia predstavuje intratekálnu syntézu IgG proti vírusom osýpok (Measles), rubeoly (Rubella) a varicely zoster (VZV). Ide o tzv. sekundárnu polyšpecifickú  protilátkovú reakciu. Táto reakcia podporuje chronický zápalový proces v CNS autoimunitnej genézy. Naopak, vylučuje akútne infekčné ochorenie nervového systému. Jej patofyziológia nie je dosiaľ objasnená. MRZ-reakcia je tvorba polyšpecifických protilátok indukovaná určitým antigénom (vírusy, baktérie), ktoré následne skrížene reagujú s neuronálnymi antigénmi. Protilátková odpoveď  v CNS pretrváva, aj keď príslušný antigén chýba. Uvedený fenomén je odrazom dlhodobého zápalu (4).

Pozitivita MRZ-reakcie:

• sclerosis multiplex (špecificita 84 – 94 %)
• systémové autoimunitné ochorenia postihujúce CNS (SLE, Sjögrenov syndróm, systémové  vaskulitídy, reumatoidná  artritída, antifosfolipidový syndróm)

Herpetické vírusy a nervový systém

Charakteristickou  vlastnosťou  herpetických  vírusov je schopnosť latentnej infekcie, najmä v gangliách  nervového systému  (HSV, VZV), v B-lymfocytoch (EBV), v monocytoch (CMV), v epitelových bunkách (CMV) i v bunkách kostnej drene. Po oslabení imunity môže dôjsť k ich reaktivácii. Väčšina herpetických vírusov je neurotropná. Podľa lokalizácie patologického procesu môžu spôsobovať meningitídy, encefalitídy, myelitídy, radikulitídy, neuritídy a iné zápalové ochorenia nervového systému (tabuľka 7).

Časté vírusové infekcie v kombinácii rôznych faktorov pôsobiacich v dlhšom časovom období (ako genetická predispozícia, pohlavie, vek, hormóny, lieky) môžu viesť až k strate tolerancie k vyvolávajúcemu  agens a následne spôsobiť vznik mnohých autoimunitných ochorení (systémových i orgánovošpecifických). O vírusoch je známe, že mechanizmom molekulového mimikry indukujú rozvoj imunopatologických procesov. Bola dokázaná zhoda v sekvencii aminokyselín (pozícia 84 – 101) myelínového bázického proteínu (MBP) a sekvenciami proteínov osýpok, CMV, EBV, humánneho herpetického vírusu 6 alebo 7, hemaglutinínu  vírusu chrípky, polymerázy HBV a koronavírusov (7).

EBV a sclerosis multiplex

Sclerosis multiplex (SM) je závažné chronické demyelinizačné ochorenie CNS autoimunitného charakteru, charakterizované deštrukciou myelínových obalov nervových vlákien s postupnou stratou oligodendrocytov a axónov. Presná príčina vzniku ochorenia nie je známa. Diagnostika SM je zložitý proces. Musí spĺňať mnohé stanovené kritériá, pričom je veľmi dôležitý likvorový nález (tabuľka 8).
V posledných rokoch sa objavili štúdie, ktoré upozorňujú  na možnú dôležitú úlohu EBV v patogenéze SM. U pacientov bola zaznamenaná prítomnosť oligoklonových  IgG gradientov so špecificitou pre EBNA1. Viac ako 95 % pacientov  so SM vykazovalo séropozitivitu protilátok proti EBNA-1 (8).

Likvorea

Likvor vytekajúci zo subarachnoidálneho  priestoru do nosových a ušných dutín je veľkým rizikom vzniku bakteriálnych meningitíd a mozgového abscesu. Identifikácia likvorey je založená  na dôkaze bielkovín typických  pre likvor, v súčasnosti najmä desialyzovanej formy transferínu (β2-transferín, tzv. asialotransferín).
V likvore sú prítomné  dve izoformy transferínu. β1-transferín je zápalo- vý marker, do likvoru sa pravdepodobne  dostáva pomocou  špecifického transportného systému, ktorý sa nachádza v bariérových systémoch mozgu. Zvýšené koncentrácie β1-transferínu nachádzame  pri všetkých neuroinfekciách. V CNS dochádza  k odštiepeniu zvyškov kyseliny sialovej pôsobením  neuroaminidázy a vzniku asialotransferínu, t. j. β2-transferínu. Táto izoforma transferínu je špecifická výlučne pre likvor (9).

Predanalytická fáza

Cytológia  likvoru: likvor treba  transportovať  v chlade  (pri 2 – 8 OC), doručiť do laboratória maximálne do 2 hodín po LP.

Špeciálne vyšetrenia: likvor (4 ml) a skúmavka zrazenej krvi (odber do skúmavky s gélom).

Likvorea: sekrét z nosa, z ucha (minimálne 0,100 ml) a skúmavka zrazenej krvi (odber do skúmavky s gélom).
Poznámka: Dlhším státím likvoru pri izbovej teplote dochádza k zmene koncentrácií niektorých parametrov. Klesá koncentrácia glukózy, stúpa koncentrácia laktátu, dochádza k rozpadu buniek (likvor na cytologické vyšetrenie je preto nutné spracovať do 3 hodín po vykonaní LP). Pri transporte vzoriek na väčšiu vzdialenosť je potrebné likvor, sekrét a sérum (pozor nie plnú krv !!!) uchovávať v chlade a následne čo v najkratšom čase doručiť do laboratória.

Indikačné obmedzenia

Neurológia  (004), pediatrická  neurológia  (104), infektológia  (002), pediatrická infektológia (331) Likvorea – neurochirurgia (037) a otorinolaryngológia (014)

Dostupnosť vyšetrenia

Centrálne laboratórium Košice

Záver

Vyšetrenie likvoru umožňuje zachytiť a následne charakterizovať patologický proces prebiehajúci v nervovom systéme. Aj keď v niektorých prípadoch je diagnostika neurologických ochorení, najmä autoimunitného pôvodu zložitá, pri interpretácii dosiahnutých  laboratórnych výsledkov netreba zabúdať na možnosť  bližšej spolupráce medzi laboratórnymi diagnostikmi a lekármi.

Literatúra

1. Duniewicz M, Adam P, et al. Neuroinfekce. 1. vyd. Praha: Maxdorf; 1999: 309.
2. Reiber H, Felgenhauer K. Protein  transfer at the blood-CSF  barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clin. Chim.Acta. 1987;163:319–328.

3. Reiber H, Peter JB. Cerebrospinal fluid analysis: diseaserelated data patterns and evaluation programs. J. NeurSci. 2001;1:101–122.
4. Reiber H, Ungefehr S, Jacobi Ch. The intrathecal, polyspecific and oligoclonal immune response in multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. 1998;4:111–117.

5. Havrdová E, Racek P, Jedlička P. Vztah intrathekální produkce IgG včetně podtříd IgG k hladinám cytokinu v mozkomíšním moku pacientů se sclerosis multiplex. Klin. Biochem.Meta 1998;6(27)4:226–229.

6. Gilden DH, Mahallingam R, Cohrs RJ, Tyler KL. Herpesvirus  infections  of the nervous sys- tem. Nature Clinical Practice Neurology. 2007;3(2).
7. Buc M. Autoimunita a autoimunitné choroby. 1. vyd. Bratislava: VEDA; 2005: 500.
8. Santiago O, et al. Relation between Epstein-Barr virus and multiple sclerosis: analytic study of scientific production. Eur. J. Clin. Microbiol.Infect.Dis. 2010;29(7):857–866.
9. Rouah E, et al. Transferrin analysis by immunofixation as an aid in the diagnosis of cerebrospinal fluid otorrhea. In Arch. Pathol.Lab.Med. 1987;111:756–757.