*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper. 

Systémová skleróza (SSc)  je zriedkavé, chronické autoimunitné ochorenie spojivového tkaniva  s neznámou príčinou  vzniku. Charakterizuje ho výrazná fibróza  kože,  degeneratívne zmeny  a vaskulárne abnormality, ktoré  postihujú kožu, kĺby a vnútorné orgány  (najmä pažerák, gastrointestinálny trakt, pľúca, srdce a obličky)(1). Na celom svete trpí týmto ochorením približne 2 – 50 zo 100 000 ľudí, pričom  postihuje 3-4x častejšie ženy ako  mužov (obvykle medzi  44. až rokom života). Vzhľadom  na  to,  že  SSc  sa prejavuje rôznymi  formami a na rôznych  častiach tela, pričom  sa dokonca môže  dostať aj do pokojovej fázy, klinická diagnóza je pomerne náročná(2).

Formy SSc:

1. Difúzna sklerodermia (dcSSc) – zhrubnutie kože na tvári, trupe a na horných i dolných končatinách.
2. Limitovaná sklerodermia (lcSSc) – zhrubnutie kože na obmedzených miestach distálne od  lakťov a kolien, ale postihuje tiež tvár a Synonymom je CREST syndróm (C – podkožná kalcifikácia,  R – Raynaudov fenomén, E – porucha motility pažeráka, S – sklerodaktýlia, T – teleangiektázia).
3. Bez kožnej sklerodermie – bez zjavných  klinických kožných prejavov (s výnimkou tváre), ale s charakteristickými zmenami na vnútorných orgánoch, cievnymi prejavmi a so sérologickými nálezmi.
4. Prekrývajúci sa syndróm – SSc spĺňajúca zároveň aj kritériá systémového lupus erythematosus (SLE), reumatoidnej artritídy (RA) alebo polymyozitídy (PM).
5. Nediferencované ochorenie spojivového tkaniva/OVER– LAP syndróm – Raynaudov fenomén s klinickými a/alebo laboratórnymi prejavmi SSc (anticentromérové protilátky, zmeny  mikrovaskulatúry, ischemické defekty, edém a ulcerácie prstov),  ale bez nálezu  zhrubnutia kože a orgánových prejavov systémovej sklerodermie(6,7).

Prítomnosť autoprotilátok je charakteristickou črtou  SSc, ale aj iných autoimunitných ochorení. Stanovenie autoprotilátok v sérach pacientov s SSc je zvlášť dôležité – napomáha pri sledovaní priebehu ochorenia, prognóze a diferenciálnej diagnostike (najmä odlíšenie od iných kolagenóz – napr. SLE, PM, Sharpov  syndróm, Sjӧgrenov syndróm)(2,3,4).

Približne v 95 % SSc prípadov  možno nájsť v sére  pacientov antinukleárne protilátky (ANA). ANA sú detegované metódou  nepriamej imunofluorescencie (NIF) na kultivovaných Hep-2 bunkách v kombinácii so  substrátom opičej  pečene. Táto metóda slúži ako skríningový  test na detekciu autoprotilátok, pretože je vysokosenzitívna a poskytuje základné informácie o detegovanej štruktúre. Na Hep-2 bunkách možno vo všeobecnosti popísať fluorescenčné obrazy, napr.  homogénne jadro, jemne  zrnité/zrnité/hrubo zrnité jadro, jadierka a iné štruktúry, ktorých prítomnosť je spôsobená rôznymi antigénmi.  Na potvrdenie konkrétneho antigénu je indikovaný imunošpecifický test (ELISA, imunoblot a pod.).  Imunoblot je metóda detekcie, pri ktorej sú na stripoch fixované  všetky v súčasnosti známe autoantigény charakteristické pre SSc, ktoré sa rozdeľujú do dvoch skupín: SSc špecifické (topoizomeráza I, centroméra-A, centroméra-B, RNA polymeráza III-RP11, -RP155) a SSc asociované (fibrilarín, NOR90, Th/To, PM-Scl100, PM-Scl75, Ku, PDGFR, Ro-52). Prevalencia autoprotilátok proti SSc antigénom je uvedená v tabuľke 1(2,3,4,5).

Autoprotilátky proti centroméram  (anti-CENP)

Anti-CENP rozoznávajú 4 proteíny, najčastejšie CENP-A,-B, -C, -D. Centromérové proteíny umožňujú väzbu kinetochórov na centromérovú oblasť chromozómov a interakciu s vretienkom  mitotického aparátu počas mitózy(5,8).

Anti-CENP sa častejšie vyskytujú pri lcSSc alebo pri CREST syndróme. Prítomnosť týchto  autoprotilátok je asociovaná s lepšou prognózou a oneskoreným nástupom postihnutia vnútorných orgánov. Takíto  pacienti majú  limitované kožné ochorenie bez  postihnutia srdca či obličiek  a zriedkavo závažnú intersticiálnu fibrózu pľúc (IF). Napriek tomu u viac ako polovice pacientov, ktorí zomierajú v súvislosti s SSc, je príčinou úmrtia pokročilá pľúcna hypertenzia (PHT). U pacientov s anti-CENP protilátkami sa nevyvinie dcSSc  a v takom  prípade nemusia byť monitorovaní pre prípadnú renálnu  krízu a intersticiálnu fibrózu(2,3,4).  Anti-CENP protilátky  boli nájdené aj v sérach pacientov s SLE, primárnou biliárnou cirhózou (PBC), RA a so Sjӧgrenovým syndrómom (SS)(4).

Mikroskopický obraz NIF ANA: 40 – 60 bodiek v interfázovom jadre, bodkovaná fluorescencia chromatínovej platničky počas mitózy (obrázok 1)(8). Vzhľadom na to, že anti-CENP vykazuje charakteristický fluorescenčný obraz, nie je potrebné potvrdenie imunošpecifickým testom.

Autoprotilátky proti topoizomeráze I (anti-Scl70)

Scl70  (70kDa)  je degradačným produktom topoizomerázy-I (topo I). Topo I je enzým lokalizovaný v nukleoplazme, jadierkach a v oblasti organizátora jadierka.  Jeho funkciou  je katalyzovať odvíjanie  dsDNA pred  syntézou dcérskych vláken DNA počas replikácie(8).

Henault  a kol. odhalili priame patogénne účinky autoprotilátok nájdených v SSc. Vo svojej štúdii uviedli, že autoantigén  topo  I uvoľnený  z apoptotických endoteliálnych buniek sa špecificky viaže na fibroblasty, kde ho u pacientov s SSc rozpozná protilátka anti-Scl70. Táto väzba  následne indukuje adhéziu a aktiváciu monocytov, ktorá vedie k vývoju SSc(10).

Protilátky anti-Scl70  sú u pacientov s SSc považované za marker  zlej prognózy. Ich prítomnosť je asociovaná s dcSSc a  so skorým nástupom postihnutia vnútorných orgánov. U pacientov s týmto  typom  autoprotilátok je vyššia  pravdepodobnosť výskytu IF v skorých štádiách, periférnej vaskulárnej choroby, postihnutia srdca, renálnej  krízy a malignít. Rôzne štúdie opisujú  asociáciu protilátok anti-Scl70  s vysokou úmrtnosťou, pričom  pacienti s IF zomierajú na komplikácie priemerne do 10 rokov po diagnostikovaní SSc(4,5). Anti-Scl70 sa zvyčajne nevyskytuje u zdravých  jedincov, ani u pacientov s Raynaudovým syndrómom alebo  s inými ochoreniami spojivového tkaniva.  Pravdepodobnosť výskytu anti-Scl70  a anti-CENP súčasne je veľmi nízka a vyskytuje sa len u 0,5 % pacientov(3).

Mikroskopický obraz NIF ANA: Jemne zrnitá až homogénna  fluorescencia jadra  v interfáze, pozitívna  fluorescencia chromatínovej platničky  počas mitózy, často s pozitívnymi jadierkami (obrázok  2)(8). Vzhľadom  na to, že fluorescenčný obraz  anti-Scl70  nie je vždy jednoznačný, je potrebné potvrdenie imunošpecifickým testom.

Autoprotilátky proti RNA polymeráze III (anti-RNAP III) RNA polymeráza III je enzým, ktorý katalyzuje prepis tRNA, časť rRNA a niektorých malých RNA. Ide o komplex proteínov pozostávajúci z > 12 podjednotiek, napr. RP11 a RP155, ktoré sú asociované s SSc(11).

Anti-RNAP III sa vyskytujú u pacientov s SSc v 5 – 20 % a sú asociované s dcSSc  a progresívnym zhrubnutím kože, vysokým  rizikom pre vývoj renálnej krízy, progresívnejším priebehom ochorenia, malignitami, bez  prítomnosti IF. Prežívanie pacientov s anti-RNAP III je v porovnaní s anti-Scl70 lepšie, pretože renálna kríza je v súčasnosti ľahšie liečiteľná ako IF. Prítomnosť protilátok anti-RNAP III u pacientov s SSc môže  byť považovaná za marker  rozvoja renálnej  krízy(4,5,9,11).

Mikroskopický obraz NIF ANA: Jemne zrnitá fluorescencia  jadra  v interfáze bunky,  chromozomálna oblasť  počas mitózy je negatívna (obrázok  2)(5,12). Fluorescenčný obraz  pri anti-RNAP III nie je jednoznačne odlíšiteľný od iných autoprotilátok s podobnou fluorescenciou, preto je potrebné potvrdenie imunošpecifickým testom.

Autoprotilátky proti Th/To

Protilátky anti-Th/To  rozoznávajú 40kDa proteín  spoločný pre dva malé  ribonukleoproteíny obsahujúce  7-2 RNA (RNá-za MRP – RNA zložka mitochondriálnej RNA endoribonukleázy) a 8-2 RNA (RNAáza P – ribonukleáza P)(8).

Anti-Th/To  protilátky  sú asociované prevažne s lcSSc formou,  hoci  celková  frekvencia u pacientov s SSc  je iba 2 – 5 %. Pacienti s protilátkou anti-Th/To majú  sklon  ku kratšiemu trvaniu Raynaudového syndrómu pred  nástupom iných symptómov, ako je napr. opuch  rúk. Závažné ischemické komplikácie sú zriedkavé,  avšak  prítomnosť tejto protilátky sa spája s IF a PHT, ktoré  sa často vyskytujú  už v skorom štádiu ochorenia. Táto zvýšená frekvencia a závažnosť pľúcnych komplikácií  vedú k horšiemu prežívaniu  v porovnaní s pacientmi s lcSSc bez prítomnosti tejto protilátky(3,4,5).

Mikroskopický obraz NIF ANA: Bodkovaná fluorescencia jadierok v interfáze bunky, chromozomálna oblasť počas mitózy je negatívna(3). Fluorescenčný obraz  pri anti-Th/To  nie je jednoznačne odlíšiteľný  od iných autoprotilátok s podobnou fluorescenciou, preto  je potrebné potvrdenie imunošpecifickým testom.

Autoprotilátky proti fibrilarínu/U3RNP

Hlavným  autoantigénom anti-U3RNP je fibrilarín, 34kDa proteín, zložka U3-ribonukleoproteínového komplexu(3,8). Prevalencia antifibrilarínu  je u pacientov s SSc 4 – 10 %(5). Anti-U3RNP protilátky sú všeobecne považované za protilátky špecifické pre  SSc  a vzájomne sa vylučujú s protilátkami anti-CENP, anti-Scl70 a anti-RNAP, boli však  opísané aj u pacientov s SLE, nediferencovaným ochorením spojivového tkaniva (UCTD) a Raynaudovým syndrómom. Niektoré klinické príznaky sú ovplyvnené  etnicitou. Belosi, Afroameričania a Japonci s anti-U3RNP trpia prevažne dcSSc, periférnou vaskulopatiou, vredmi a gangrénou. U belochov a Afroameričanov  je v porovnaní s Japoncami opísané častejšie postihnutie orgánov, IF, PHT či renálna kríza a s nimi súvisiaca horšia prognóza. Prítomnosť anti-U3RNP u pacientov s lcSSc vylučuje rozvoj PHT(3,13).

Mikroskopický  obraz  NIF ANA: Chuchvalcovitá  fluorescencia jadierok  v  interfáze, bunky  v  mitóze vykazujú perichromozomálnu fluorescenciu (14). Fluorescenčný obraz pri anti-U3RNP nie je jednoznačne odlíšiteľný od iných autoprotilátok s podobnou fluorescenciou, preto  je potrebné potvrdenie imunošpecifickým testom.

Autoprotilátky proti NOR90

Protilátky anti-NOR90 sú namierené proti oblasti organizácie jadierka  (NOR), kde sa po mitóze formujú  jadierka.  Štúdie preukázali, že autoantigénom pre protilátku anti-NOR90 je transkripčný faktor RNA polymerázy I viažuci sa proti smeru transkripcie (hUBF)(5,8).

Anti-NOR90 nepatria medzi  SSc špecifické protilátky, avšak boli detegované u pacientov s ochoreniami spojivového tkaniva  ako Raynaudov syndróm, RA, SLE, SS a u pacientov s malignitami. Čoraz častejšie sa spomína asociácia medzi protilátkami anti-NOR90 a lcSSc, miernou  formou  postihnutia kože a priaznivou  prognózou (3,4).

Mikroskopický obraz NIF ANA: Zrnitá fluorescencia jadierok počas interfázy.  V chromatínovej oblasti mitotickej bunky pozorované bodky, ktoré  sú  považované za oblasť  organizácie jadierka(8). Fluorescenčný obraz  pri anti-NOR90 nie je jednoznačne odlíšiteľný  od iných autoprotilátok s podobnou fluorescenciou, preto  je potrebné potvrdenie imunošpecifickým testom.

Autoprotilátky proti PM-Scl75,  PM-Scl100

Autoantigén PM-Scl je makromolekulový komplex 11 – 16 polypeptidov, z ktorých najdôležitejšie majú molekulovú hmotnosť 75kDa a 100kDa:  anti-PM-Scl75,  anti-PM-Scl100. V bunkovom jadre  sa zúčastňuje na štiepení prekurzorovej rRNA a v cytoplazme napomáha degradovať zrelú mRNA(15).

Zatiaľ čo autoprotilátky proti CENP a Scl70 sú typické pre SSc, o autoprotilátkach proti PM-Scl75 a PM-Scl100 sa uvažuje  ako  o sérologických markeroch pre  overlap  syndróm, pričom  PM-Scl75 by mohol  pôsobiť  ako hlavný cieľový antigén pri dcSSc. Anti-PM-Scl protilátky  sa najčastejšie vyskytujú u pacientov s prekrývajúcim sa syndrómom PM a SSc (31 %), vzácnejšie pri samotnej myozitíde (8 – 11 %) alebo SSc (2 %)(15,19). Pacienti s týmto  typom autoprotilátok často trpia  subakútnou myozitídou,  Raynaudovým fenoménom a sklerodermiou kože(5).  Dôkaz týchto  autoprotilátok je spojený s lepšou prognózou ochorenia(15).

Mikroskopický obraz NIF ANA: Homogénna fluorescencia  jadierok  a súčasne slabšia, jemne  zrnitá  fluorescencia nukleoplazmy v interfáze, negatívna fluorescencia chromatínovej platničky počas mitózy(14).  Fluorescenčný obraz  pri anti-PM-Scl75, -100 nie je jednoznačne odlíšiteľný od iných autoprotilátok s podobnou fluorescenciou, preto  je potrebné potvrdenie imunošpecifickým testom.

Autoprotilátky proti Ku

Anti-Ku protilátky boli opísané ako marker overlap syndrómu sklerodermie/PM, avšak  zaznamenaný bol aj ich výskyt pri iných autoimunitných ochoreniach. Autoantigénom pre anti-Ku je proteín  Ku s dvoma  podjednotkami, viažuci DNA, zúčastňujúci sa na oprave  dsDNA. Prevalencia anti-Ku protilátok u SSc pacientov je 1,5 – 16 %(3,16,17).

Anti-Ku je primárne detegované u SSc pacientov s overlap syndrómom. Väčšina pacientov má typické príznaky ako Raynaudov fenomén, sklerodermia kože a obvykle aj lcSSc(5).

Anti-Ku sa zriedkavo vyskytuje aj u pacientov s SLE bez znakov SSc, pričom  ďalšie autoprotilátky asociované s SLE, napr. anti-dsDNA, sú vždy pozitívne. Menej často sa vyskytuje postihnutie vnútorných orgánov, ktoré je však mierne, zatiaľ čo artritída  je bežná. Anti-Ku protilátka je taktiež  asociovaná s menším počtom vaskulárnych prejavov, ako je napr. teleangiektázia(18).

Mikroskopický obraz NIF ANA: Jemne zrnitá  až  škvrnitá fluorescencia jadra v interfáze, chromozomálna oblasť počas mitózy  je negatívna. Anti-Ku možno odlíšiť od iných autoprotilátok na  základe substrátu opičej  pečene, na  kto- rom  vykazuje  perinukleárnu  až  chumáčikovitú fluorescenciu(8). Vzhľadom  na to, že fluorescenčný obraz  anti-Ku nie je vždy jednoznačný, je potrebné potvrdenie imunošpecifickým testom.

Autoprotilátky proti PDGFR (platelet derived growth factor – rastový faktor odvodený od trombocytov)

Anti-PDGFR patria medzi protilátky asociované s SSc a boli detegované aj pri iných ochoreniach: SLE, SS, RA a IF(4). Jedným z prvých prejavov v patogenéze SSc je mikrovaskulatórne poškodenie a akumulácia buniek exprimujúcich receptor PDGFR. Autoprotilátky anti-PDGFR hrajú úlohu v patogenéze SSc, pretože konvertujú  normálne fibroblasty in vitro na bunky podobné SSc, ktoré sú schopné indukovať fibrózu in vivo. Ďalšie štúdie týchto  protilátok môžu pomôcť  v prevencii  závažných  komplikácií,  ako sú  ulcerácie, PHT a renálna kríza, ktoré sú zodpovedné za podstatné skrátenie času prežívania a zhoršenie kvality života(20).

Mikroskopický obraz NIF ANA: Nie je opísaný špecifický fluorescenčný obraz,  preto  jediná  možnosť dôkazu anti-PDGFR je imunošpecifický test.

Záver

Autoprotilátky  detegované pri SSc  sú veľmi špecifické a asociované s rôznymi klinickými prejavmi pacienta. Ich prítomnosť by mala byť zvážená pri monitorovaní pacienta, stanovení liečby a ďalšej  prognóze. Objasnenie špecificity SSc protilátok a s nimi súvisiacich odlišných klinických prejavov by mohlo napomôcť lepšie  pochopiť  patogenézu SSc.  Význam autoprotilátok pri SSc ochorení je stále pomerne nejasný, aj keď čoraz viac štúdií nasvedčuje tomu, že tieto protilátky nie sú len diagnostickými markermi ochorenia, ale taktiež vedia  predpovedať vývoj ochorenia či prípadné postihnutie orgánov.

LITERATÚRA

1. Rovenský J, Vašáková  M. Sine syndróm  pri systémovej skleróze. Via practica. 2010; 7(6): 262-265.
2. EUROIMMUN: Protilátky proti specifickým antigénum systémové sklerózy. Návod na provedení  testu Systemic Sclerosis (Nucleoli) Profile EUROLINE (IgG).
3. Hamaguchi Y. Autoantibody  profiles in systemic sclerosis: Predictive value for clinical evaluation  and prognosis. Journal of Dermatology 2010; 37: 42-53.

4. Wielosz E, Dryglewska M, Majdan  M. Serological  profile of patients with  systemic sclerosis.  Postepy Hig Med  Dosw  (online)  2014;  68: 987-991. e-ISSN 1732-2693.

5. Kuwana M. Circulating anti-nuclear antibodies in Systemic sclerosi: utility in diagnosis and disease subsetting. J Nippon Med Sch 2017; 84(2): 56-63.

6. Bečvář R. Současný pohled na diagnostiku a léčbu systémové sklerodermie a Sjögrenova syndromu. Med Pro Praxi 2008; 5(3): 109-112.

7. Shoenfeld Y, Meroni PL. The General Practice Guide to Autoimmune Diseases. Pabst Science Publishers 2012: ISBN 978-3-89967-770-6

8. Bradwell AR, Hughes  RG. Atlas of HEp-2 patterns. The Binding Site Ltd. 2007: ISBN 0704425955.

10. Steen  VD. Autoantibodies  in Systemic Sclerosis.  Semin  Arthritis Rheum 2005; 35: 35-42.
11. Henault J, Robitaille G, Senecal JL, a spol. DNA topoisomerase I binding to fibroblasts induces monocyte adhesion and activation in the presence of antiopoisomerase I autoantibodies from systemic sclerosis patients.  Arthritis Rheum 2006; 54: 963-973.
12. Kuwana M, Kimura K, Kawakami Y. Identification of an Immunodominant Epitope on RNA Polymerase III Recognized by Systemic Sclerosis Se- ra: Application to Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Arthritis & Rheumatism 2002; 46: 2742-2747.
13. Parker JC, Burlingame RW, Webb TT, a spol. Anti-RNA polymerase III antibodies in patients with systemic sclerosis detected by indirect immu- nofluorescence and ELISA. Rheumatology (Oxford) 2008; 47(7): 976-979.
14. Ho KT, Reveille JD. The clinical relevance of autoantibodies in scleroderma. Arthritis Research & therapy 2003; 5(2): 80-93.

14. https://www.euroimmun.com/documents/Indications/Autoimmunity/Rheumatology/ANA/FA_1510_I_UK_B.pdf

15. Pleštilová L,  Vencovský  J.  Anti-PM-Scl  protilátky  u myositid.  Čes Revmatol 2009; 17(4): 200-204.

16. Hoa S, Hudson M, Troyanov Y, a spol.  Single-specificity  anti-Ku antibodies  in an international cohort  of 2140  systemic sclerosis subjects: clinical associations. Medicine 2016; 95: 35.
17. Mimori T, Akizuki M, Yamagata H, a spol. Characterization of a high molecular weight acidic nuclear protein recognized by autoantibodies in sera from patients with polymyositis-scleroderma overlap. J Clin Investig. 1981; 68: 611-620.

18. Rozman B, Cucnik S, Sodin-Semrl S, a spol. Prevalence and clinical associations of anti-Ku antibodies in patients with systemic sclerosis: a European EUSTAR-initiated multi-centre case-control study. Ann Rheum Dis 2008; 67: 1282-1286.

19.  http://arthritis-researbiomedcentral.com/articles/10.1186/ar2614
20. Svegliati S, Amico D, Spadoni T, a spol. Agonistic Anti-PDGFR receptor autoantibodies from patients with systemic sclerosis impact  human pulmonary  artery smooth muscle cells function  in vitro. Frontiers  in Im- munology 2017; 8: 75.
21. Archív Imunológia, Medirex.
22. https://www.researchgate.net/figure/45281682_fig7_Fig-8-Fine- grainy-nucleoplasmic-staining-Scl-70-like