*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper. 

Úvod

IgA nefropatia (IgAN) je najčastejšou primárnou glomerulonefritídou u adolescentov a dospelých. Od nástupu klinických príznakov progreduje do koncového štádia obličkového ochorenia 1,5 % pacientov ročne  a približne 25 – 30 % pacientov vyžaduje  dialýzu alebo  transplantáciu obličky do 20 – 25 rokov trvania  ochorenia. Japonskí autori  uvádzajú aj pomerne vysoký výskyt subklinickej  formy IgAN („lanthanic IgAN“), ktorú histologicky potvrdili u 16 % potenciálnych žijúcich darcov obličky bez akýchkoľvek klinických prejavov choroby(1). Typickými klinickými príznakmi v čase stanovenia diagnózy sú hematúria alebo  kombinácia hematúrie s mierne  až  stredne závažnou proteinúriou (< 2 g/24 h), pričom hematúria je často asociovaná s infekciou horných  dýchacích ciest. Niektorí pacienti majú už v čase stanovenia diagnózy príznaky  zlyhávania obličiek a hypertenziu(2). Pre IgAN je charakteristická mužská predispozícia, nástup ochorenia v druhej  až tretej  dekáde života, široké  spektrum klinických príznakov  a variabilná  rýchlosť  progresie ochorenia po stanovení diagnózy(1).

Potvrdenie diagnózy IgAN naďalej  vyžaduje  biopsiu obličky(2). Charakteristickým histopatologickým znakom sú renálne  depozity cirkulujúcich imunokomplexov s dôkazom imunoglobulínu A (IgA) v mezangiu glomerulov často sprevádzaného imunoglobulínom G (IgG) a C3 zložkou  komplementu(3). Približne 50 % pacientov s IgAN má zvýšené hodnoty IgA a IgA obsahujúcich imunokomplexy v sére(4).

IgAN je definovaná ako  autoimunitné ochorenie s typickou patogenézou viacerých úderov (multi-hit), ktorá je modulovaná  rôznymi genetickými aj vonkajšími  faktormi. Kľúčovú úlohu  v patogenéze IgAN má  degalaktozylovaná forma  IgA1 (Gd-IgA1)(2). Pôvod  buniek secernujúcich Gd-IgA1 nie je presne známy. Cirkulujúci IgA1 je produkovaný hlavne v kostnej dreni, kým Gd-IgA1 môže  byť syntetizovaný ako  odpoveď na  slizničnú  infekciu.  Predpokladá sa,  že abnormality  v slizničnej  odpovedi na bežný  mikrobiálny  alebo potravinový  antigén môžu  preto  viesť k produkcii Gd-IgA1(5).

Podtriedy IgA1 a IgA2 sa líšia hlavne prítomnosťou unikátnej dlhej závesnej oblasti tzv. „hinge“ regiónu u IgA1. Táto závesná oblasť je tvorená reťazcom 18 aminokyselín, na ktoré sa môže  viazať až šesť  sacharidových zvyškov O-glykozylovou väzbou(6). (obrázok 1)

U zdravých  jedincov je väčšina O-reťazcov kompletne glykozylovaná s Gal (najmenej štyri až  šesť reťazcov  je kompletných),  kým väčšina reťazcov  u pacientov s IgAN je nekompletne galakozylovaných alebo  skrátených (najviac  dva reťazce zo šiestich sú kompletné)(6). Gd-IgA1 sa uplatňuje ako autoantigén, ktorý je rozlišovaný špecifickými autoprotilátkami s následnou tvorbou  cirkulujúcich imunokomplexov(3).

Vysoké  koncentrácie Gd-IgA1 sami  o sebe nevedú  k poškodeniu obličiek.  V patogenéze ochorenia vyúsťujúcej  do renálneho poškodenia sa uplatňujú štyri procesy – aberantná  glykozylácia IgA1, syntéza protilátok proti  Gd-IgA1, formácia imunokomplexov a ukladanie imunokomplexov v mezangiu obličiek(5).

Tieto komplexy nie sú efektívne  metabolizované pečeňou, čo vedie k tvorbe  glomerulových depozitov, aktivácii a proliferácii mezangiálnych buniek, lokálnej aktivácii komplementu, produkcii  extracelulárnej matrix  a cytokínov, ktoré  môžu ovplyvniť expresiu génov  podocytmi a glomerulárnu permeabilitu. Postihnutie mezangia a podocytov vedie k proteinúrii a tubulointersticiálnym zmenám(2).

IgAN predstavuje systémové ochorenie, čo potvrdzuje aj fakt, že pri transplantácii obličky darcu  so subklinickou IgAN príjemcovi  s non-IgAN obličkovou chorobou došlo  krátko po transplantácii obličky k vymiznutiu depozitov IgA(5).

Prvé testy na detekciu Gd-IgA1 boli založené na väzbovej aktivite voči špecifickým lektínom – helix aspersa (HAA), helix promatia (HPA) alebo  vicia villosa (VV) – prírodne  sa vyskytujúce molekuly  s vysokou  väzbovou kapacitou voči sacharidovým zvyškom so špecifickosťou ku GalNAc zvyškom. Yasutake a kol. vyvinuli ELISA test použitím novej Gd-IgA1 špecifickej monoklonovej protilátky KM55(7). V súčasnosti sú pre klinickú prax dostupné aj ďalšie  testy,  ktorými možno stanoviť  koncentrácie Gd-IgA1. V našej práci  sme použili systém Human  Galactose-Deficient IgA1

ELISA Kit firmy  Abbexa.  Princípom vyšetrenia  je  zmena sfarbenia produktu po naviazaní protilátky (chicken anti-Galactose-Deficient IgA1) na cieľový antigén (Protein A). Intenzita novovzniknutého žltého  sfarbenia je proporcionálna ku koncentrácii GdIgA1. O.D. absorbancia je meraná spektrofotometricky pri 450 nm.

Cieľom našej práce bolo  overenie klinickej využiteľnosti komerčne dostupného setu na stanovenie Gd-IgA1 pri diagnostike a sledovaní aktivity IgA nefropatie.

Materiál a metodika

Do  nami   vyšetrovaného súboru sme  zaradili   87  vzoriek  pacientov a  zdravých kontrol  zozbieraných v období 12. 2016 – 30. 04. 2017. Celý súbor sme rozdelili na štyri skupiny:

– skupina 1:  pacienti  so základnou diagnózou IgAN po transplantácii obličky (n = 14),

–  skupina 2: pacienti po transplantácii obličky, ktorí nemajú IgAN ako základnú diagnózu a ani glomerulové zmeny v protokolárnej biopsii transplantovanej obličky (n = 25),

–  skupina 3: pacienti s biopticky  dokázanou IgAN (n = 4) a suspektnou IgAN na základe klinických a laboratórnych nálezov (n = 23),

–  skupina 4: zdravé  kontroly (n = 21).

Detailnejšie údaje  o podskupinách vyšetrovaného súboru sú v tabuľke 1.

Pacienti s IgAN v skupine 1 boli 9 – 83 mesiacov po transplantácii obličky, najčastejším typom  liečby bola  trojkombinácia  imunosupresív – kortikoidy, mykofenolát sodný  a takrolimus  (78,5  % pacientov). 12  pacientov malo  funkčnú transplantovanú obličku, 1 pacientka mala  zlyhávajúci  štep a 1 pacient bol po zlyhaní štepu v dôsledku rekurencie IgAN znovuzaradený do  hemodialyzačného programu. V skupine 2 mali všetci  pacienti stabilnú funkciu transplantovanej obličky, 88 % z nich malo štandardnú imunosupresívnu liečbu (kortikoidy, mykofenolát sodný  a takrolimus) a doba  od transplantácie bola 1 – 83 mesiacov. Na štatistické spracovanie sme použili Kruskal-Wallisov test, údaje  sme spracovali programom SPSS1.

Výsledky

Priemerné sérové koncentrácie Gd-IgA1 v skupinách 1, 2, 3 a 4 boli: 58,05 μg/l, 10,53 μg/l, 165,2 μg/l a 6,4 μg/l  – graf 1. Štatisticky významné rozdiely medzi  vyšetrovanými skupinami a kontrolami a ani medzi  jednotlivými skupinami pacientov sme nezistili.

Zvýšené  hodnoty Gd-IgA1 malo  6 pacientov (7 %) z celého súboru – jedna  pacientka v skupine 1 a piati pacienti zo skupiny 3. Koncentrácie Gd-IgA1 u týchto  pacientov dosahovali 43 – 152-násobok priemernej koncentrácie Gd-IgA1 u zdravých  kontrol.  V tabuľke 2 uvádzame vybrané  klinické a laboratórne charakteristiky pacientov so  zvýšenými sérovými koncentráciami Gd-IgA1. U pacientky po transplantácii obličky bola koncentrácia Gd-IgA1 stanovená v čase akútneho zhoršenia funkcie  štepu. V histologickom vyšetrení neboli opísané patologické morfologické zmeny  glomerulov, ale chýba nám  imunofluorescenčné vyšetrenie. U pacientky 2 s  histologicky potvrdenou IgAN bol po redukcii  imunosupresie pri stabilnom funkčnom renálnom náleze zaznamenaný vzostup sérového kreatinínu a proteinúrie. Pacienti 3 a 4 nemajú realizovanú renálnu  biopsiu.  U týchto  pacientov môžu zvýšené hodnoty Gd-IgA1 podporovať diagnózu IgAN. Prekvapivé sú nálezy u pacientov 5 a 6, ktorí majú biopticky potvrdenú  FSGS a malé  abnormality glomerulov s negatívnou expresiou IgA pri imunofluorescenčnom vyšetrení. V prvej skupine boli dvaja pacienti so včasným zlyhaním transplantovanej obličky v dôsledku rekurencie IgAN, u ktorých sa zvýšené hodnoty Gd-IgA1 nepotvrdili.

Diskusia

Neinvazívne biomarkery IgAN by mohli potenciálne  viesť ku skoršej diagnostike ochorenia, k detailnejšiemu monitorovaniu klinického  priebehu ako aj odpovede na liečbu. Hlavným  kandidátom spomedzi týchto  biomarkerov je Gd-IgA1(8). Moldoveanu a kol. vyšetrili Gd-IgA1 ako diagnostický marker  u pacientov s IgAN. Analýza ROCC (Receiver  Operating Characteristic Curve) potvrdila  senzitivitu 0,77 a špecifickosť 0,90 pri rozlíšení  pacientov s IgAN od zdravých  kontrol(5). Viaceré  štúdie potvrdili zvýšenie Gd-IgA1 u pacientov s IgAN v porovnaní so zdravými kontrolami(9). V našom súbore pacientov sme toto pozorovanie nepotvrdili, čo vysvetľujeme malým počtom pacientov s histologicky potvrdenou IgAN a možným vplyvom imunosupresívnej liečby u časti pacientov. Zvýšené  hodnoty Gd-IgA1 boli opísané u pacientov kaukazského, ázijského aj afrického pôvodu s variáciou u jednotlivých pohlaví a etnických skupín.  Zvýšené  hodnoty Gd-IgA1 boli pozorované aj u 5 % zdravých  jedincov(8). 40 – 50 % prvostupňových príbuzných chorých má  zvýšené hodnoty Gd-IgA1 porovnateľné s hodnotami pacientov, z čoho  vyplýva vysoký podiel dedičnosti na tomto ochorení  a taktiež fakt, že aberantná glykozylácia IgA1 predchádza klinicky zjavnú  chorobu a predstavuje dedičný  rizikový faktor IgAN. Tento  dedičný  defekt však  nepostačuje na vyvolanie IgAN, o čom  svedčí  aj to, že nie všetky  osoby  so  zvýšenou hodnotou Gd-IgA1 majú klinickú symptomatológiu renálneho postihnutia a že pri poškodení obličiek sa uplatňujú aj ďalšie patofyziologické mechanizmy(5). V našom súbore máme zaradený  príbuzenský pár rodič – dieťa, v ktorom  príjemca obličky má IgAN. Ani jeden z vyšetrovaných nemá v súčasnosti zvýšené hodnoty Gd-IgA1, avšak je potrebné sledovanie dynamiky koncentrácií Gd-IgA1, prípadne aj iných neinvazív- nych markerov IgAN, ktoré uvádzame v tabuľke 3. Pre skupinu pacientov s kontraindikáciou renálnej  biopsie,  ako sú pacienti so solitárnou obličkou vrátane žijúcich darcov  obličky, je dostupnosť uvedených vyšetrení veľmi významná.

V súvislosti so  zistením zvýšenej hodnoty Gd-IgA1 u pacientov s inými typmi glomerulopatií (FSGS a malé abnormality glomerulov) sme v literatúre našli údaj o asociácii nefritídy a Gd-IgA1 komplexov u chorých  s Henochovou-Schoenleinovou purpurou a IgA1 myelómom(10). Pacient 6 má v anamnéze potravinovú alergiu, ktorá je spojená s poruchou slizničnej imunity, a preto na základe literárnych údajov možno predpokladať aj tento  mechanizmus zvýšenej produkcie Gd-IgA1(5).

Podľa  Zhao  a kol. sú  vysoké  hodnoty sérového Gd-IgA1 asociované aj so zvýšeným rizikom progresie ochorenia a majú prognostický význam(9), podľa niektorých štúdií  však  sérové hodnoty Gd-IgA1 nekorelujú s hodnotou proteinúrie a s poklesom glomerulovej filtrácie, ale percento Gd-IgA1/celkové IgA koreluje  s klinickými faktormi  nepriaznivej prognózy, ktorými sú pokles glomerulovej filtrácie a závažnosť proteinúrie(8).

Jedným z cieľov našej štúdie bolo interpretovať hodnoty Gd-IgA1 v skupine pacientov s IgAN po transplantácii obličky, ktorí užívajú imunosupresívnu liečbu.  Je dokázané, že imunosupresívna terapia ovplyvňuje hodnoty Gd-IgA1. Kim a kol. (2016) hodnotili vplyv imunosupresívnej liečby na koncentrácie Gd-IgA1 po 3 a 6 mesiacoch od transplantácie, pričom po 3 mesiacoch bola  imunosupresívna liečba  redukovaná.

Hodnoty  Gd-IgA1 boli signifikantne nižšie po 3 mesiacoch od transplantácie, po redukcii  imunosupresívnej liečby boli hodnoty Gd-IgA1 po 6 mesiacoch signifikantne vyššie.  Zmeny koncentrácií Gd-IgA1 boli asociované hlavne so zmenami v dávkovaní prednizónu(11). V čase odberu krvných vzoriek na stanovenie Gd-IgA1 užívalo prednizón 93 % pacientov v skupine 1 a 92 % pacientov v skupine 2. Priemerná dávka prednizónu bola 7,5 mg v oboch skupinách. Vyšetrenie Gd-IgA1 bolo zrealizované iba raz, čo považujeme za nedostatok našej štúdie. Preto  u našich pacientov nemôžeme hodnotiť  vplyv redukcie dávky prednizónu na koncentráciu Gd-IgA1.

Rekurencia IgAN v transplantovanej obličke po transplantácii nie je zriedkavá. Histologické známky rekurencie možno nájsť až u 60 % pacientov, pričom  25 % má známky dysfunkcie štepu a u 5 % pacientov vedie  rekurencia IgAN k strate štepu(12). Berthelot  a kol. (2015)  potvrdili, že pacienti s rekurenciou IgAN po transplantácii obličky mali vyššie koncentrácie Gd-IgA1 predtransplantačne ako transplantovaní pacienti bez rekurencie a ako kontrolná skupina pacientov(13). Pre našu analýzu  sme nemali  k dispozícii  predtransplantačné séra na vyšetrenie Gd-IgA1. V súbore pacientov sú dvaja pacienti s rekurenciou IgAN, ktorá viedla k zlyhaniu štepu. Títo pacienti nemali zvýšené koncentrácie Gd-IgA1. Niektorí autori však uvádzajú vyššiu prediktívnu hodnotu ostatných biomarkerov, ako sú napr.  protilátky proti Gd-IgA1 a solubilné CD89 komplexy. Prehľad  týchto  biomarkerov uvádzame v tabuľke 3.

Yanagawa a kol. (2014) potvrdili signifikantne vyššie hodnoty sérových anti-Gd-IgA1 IgG a IgA autoprotilátok u pacientov s IgAN v porovnaní s pacientmi s non-IgAN chronickou obličkovou chorobou. 91 % pacientov s IgAN a normálnou hodnotou Gd-IgA1 malo  zvýšené hodnoty anti-Gd-IgA1 IgG autoprotilátok, produkcia autoprotilátok je preto  pravdepodobne nezávislá od koncentrácie Gd-IgA1.

Sérové hodnoty anti-Gd-IgA1 IgA autoprotilátok korelujú s intenzitou mezangiálnych IgA depozitov a sérové hodnoty IgG autoprotilátok sú asociované s histologickým stupňom a so závažnosťou proteinúrie(14).

Záver

Stanovenie diagnózy IgAN, najčastejšej primárnej glomerulonefritídy  v adolescentnom a dospelom veku, vyžaduje biopsiu  obličky. V klinickej praxi sú veľmi cenné neinvazívne metódy,  ktoré   slúžia  na  monitorovanie  aktivity  choroby a umožňujú individualizovať  liečbu  a minimalizovať jej nežiaduce účinky. V práci poskytujeme literárny prehľad potenciálnych biomarkerov relevantných pre IgAN a prvé výsledky stanovenia Gd-IgA1 u chorých s chronickým nefritickým syndrómom a nefrotickým syndrómom. Významnejší potenciál opisovaného vyšetrenia možno očakávať pri pravidelnom dlhodobejšom vyšetrovaní pacientov.

LITERATÚRA

1. Barratt J and Feehally J. IgA Nephropathy. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 2088-2097.

2. Maixnerova D, Reily C, Bian Q, et al. Markers for the progression of IgA nephropathy. J Nephrol 2016; 29(4): 535-541.

3. Raška  M, Zadražil J, Stuchlová  Horynová M, a kol. IgA nefropatie – otázky, které nastolil výzkum. Vnitř Lék 2016; 62(12 Suppl 6): 6S67-6S77.

4. Moldoveanu  Z, Wyatt RJ, Lee JY, et al. Patients with IgA nephropathy have increased serum galactose-deficient IgA1 levels. Kidney International 2007; 71: 1148- 1154.

8. Suzuki  H,  Kiryluk K,  Novak  J,  et  al.  The  Pathophysiology  of  IgA Nephropathy. J Am Soc Nephrol 2011; 22: 1795-1803.
9. Berthoux F, Mohey H, Maillard N, et al. IgA nephropathy: new aspects in pathophysiology and pathogenesis. EMJ Neph 2015; 3(1): 97-103.
10. Coppo R. A new monoclonal antibody for detecting degalactosylated IgA1 as  serum biomarker of IgA nephropathy. Nephrol  Dial Transplant 2015; 30: 1234-1236.
11. Hastings MC, Moldoveanu Z, Suzuki  H, et  al.  Biomarkers in IgA nephropathy: relationship to pathogenetic hits. Expert Opin Med Diagn 2013; 7(6): 615-627.
12. Zhao  N, Hou P, Lv J, et al. The level of galactose-deficient IgA1 in the  sera of patients  with IgA nephropathy is  associated with disease progression. Kidney Int 2012; 82(7): 790-796.
13. Knoppova B, Reily C, Maillard N, et al. The origin and  Activities of IgA1 – Containing Immune Complexes in IgA Nephropathy. Front Immunol 2016; 7: 117.

11. Kim MJ, Schaubi S, Molyneux K, et al. Effect of Immunosuppressive Drugs on the Changes of Serum Galactose-Deficient IgA1 in Patients with IgA Nephropathy. PLoS ONE 2016; 11(12): e0166830.
12. Floege J. Recurrent   IgA  nephropathy after  renal  transplantation. Semin Nephrol 2014; 24(3): 287-291.

13. Berthelot L, Robert T, Vuiblet V, et al. Recurrent IgA nephropathy is predicted by altered  glycosylated IgA, autoantibodies and soluble  CD 89 complexes. Kidney Int. 2015; 88(4): 815-822.
14. Yanagawa H, Suzuki H, Suzuki Y, et al. A Panel of Serum Biomarkers Differentiates IgA Nephropathy from Other Renal Diseases. PLoS ONE 2014; 9(5): e98081.

15. Boyd J, Cheung ChK, Molyneux K, et al. An update on the pathogenesis and treatment of IgA nephropathy. Kidney International 2012; 81: 833- 84