*A rare case of autochthonous human dirofilariasis with the manifestation of pseudotumor of the epididymis caused by helminth Dirofilaria repens

Úvod

Glykozylácia je esenciálna modifikácia proteínov, ktorá zásadne ovplyvňuje ich funkciu, stabilitu, aktivitu a mnohé iné vlastnosti. Na rozdiel od transkripcie a translácie je to netemplátový proces, katalyzovaný stovkami rôznych enzýmov a transportérov, prebiehajúci v endoplazmatickom retikule, Golgiho aparáte a cytozole. Dnes je známe, že porucha homeostázy organizmu môže negatívne ovplyvniť súhru týchto glykozylačných metabolických kaskád. Aberantná glykozylácia bola pozorovaná pri rôznych onkologických, neurodegeneratívnych, autoimunitných a iných ochoreniach(1-3) pravdepodobne ako sekundárny jav; ale takisto pri kongenitálnych poruchách glykozylácie (CDG), ktoré sú primárne spôsobené mutáciou génov komplexnej glykozylačnej dráhy.
Pôvodne sa skupina CDG delila na dva typy (typ I a II) podľa profilu IEF transferínu (Tf), pričom do skupiny CDG I patrili defekty spôsobené pri syntéze N-glykánov vzniknuté v cytozole alebo v endoplazmatickom retikule a do CDG II defekty vzniknuté v Golgiho aparáte pri úprave glykánov. Toto rozde-lenie zahŕňalo len poruchy N-glykozylácie. Vzhľadom na narastajúci počet ochorení a neustále odhaľovanie nových porúch v dráhach glykozylácie bolo nutné po opísaní viac ako 40 ochorení v roku 2009 klasifikáciu aj nomenklatúru zmeniť. Na označenie ochorenia sa v súčasnosti používa názov mutova-ného génu spolu so skratkou CDG. V súčasnosti je známych viac ako 160 rôznych porúch glykozylácie. Nová klasifikácia rozdeľuje celú skupinu na: (a) poruchy N-glykozylácie proteí-nov, (b) poruchy O-glykozylácie proteínov, (c) poruchy syntézy glykozylfosfatidylinozitolovej kotvy a glykolipidov, (d) poruchy viacerých dráh glykozylácie a poruchy ostatných dráh.
Biochemickým skríningom N-glykozylačných, O-glykozylačných a zmiešaných porúch a porúch syntézy dolicholu je IEF Tf, apolipoproteínu C-III zo séra a vyšetrenie profilu dolicholov v moči.
Klinické príznaky CDG často zahŕňajú multiorgánové postihnutie. Medzi častými nálezmi sú polystigmatizácia, poruchy rastu, psychomotorická retardácia, poruchy imunity, hypotónia, záchvaty a muskuloskeletové abnormality. Klinické manifestácie takmer u všetkých CDG pacientov sa objavujú už v dojčenskom veku(4). Biochemické parametre zahŕňajú koagulopatie a zvýšené hladiny pečeňových transamináz. V  prípade PMM2-CDG, subtypu s  celosvetovo najvyššou frekvenciou výskytu heterogenita klinických prejavov zahŕňa skorú neonatálnu mortalitu až po dosiahnutie normálnej do-spelosti(5). Korelácie medzi genotypom a fenotypom sú u jednotlivých pacientov veľmi variabilné, čo spolu s nešpecifickými klinickými príznakmi zaraďuje tieto ochorenia medzi ťažko diagnostikovateľné.

Materiál a metóda

V roku 2012 bol v Centre dedičných metabolických porúch (CDMP) NÚDCH zavedený selektívny skríning CDG založený na metóde izoelektrickej fokusácie (IEF) sérového transferínu. Za obdobie rokov 2012 – 2020 bolo celkovo analyzo vaných 3 600 vzoriek pacientov so suspektným podozrením na CDG odoslaných z metabolických ambulancií a klinických pracovísk v rámci celého Slovenska. Princíp IEF Tf spočíva v separácii izoforiem transferínu (biomarkera nesúceho dve N-glykozylačné miesta) na základe ich izoelektrického bodu s následnou imunodetekciou a denzitometrickou kvantifikáciou. Metóda umožňuje rozlíšiť poruchu glykozylácie v syntéze oligosacharidického prekurzora v endoplazmatickom retikule (CDG typ I) od poruchy v procesovaní glykánov (CDG typ II), ktoré prebieha v Golgiho aparáte. Táto metóda je veľ-mi spoľahlivá, reprodukovateľná a predstavuje celosvetovo tzv. zlatý štandard pre CDG diagnostiku, nedokáže však určiť konkrétne miesto prerušenia glykozylačnej metabolickej dráhy. Odhaduje sa, že až 40 % zachytených CDG pacientov stále nemá potvrdenú presnú molekulárnu podstatu(6). Diagnostika týchto zriedkavých ochorení vyžaduje personalizovaný prístup, kde nachádza svoje uplatnenie spolupráca klinických diagnostikov s vedeckými laboratóriami.
Chemický ústav Slovenskej akadémie vied sa vďaka boha-tým skúsenostiam v oblasti štruktúrnej analýzy glykokonjugátov zapojil do regionálnej (CDMP NÚDCH) i medzinárodnej spolupráce (v rámci CDG & ALLIES – PPAIN siete). Zavedený štandardný operačný protokol analýzy N-glykoprofilu využíva 10 mikrolitrov krvného séra alebo približne 100 mikrogramov imunoafinitne izolovaného glykobiomarkera (napr. Tf). Glykány sú enzymaticky odštiepené a separované od proteínov prostredníctvom „solidphase extrakcie“. S cieľom zvýšenia intenzít signálov v následne nameraných MALDI TOF hmotnostných spektrách (MS) sa vzorky derivatizujú permetyláciou. V prípade potreby kvantifikácie jednotlivých štruktúr sa využíva vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) v  kombinácii s  MS. Reprezentatívny glykoprofil Tf získaný zo vzorky negatívnej kontroly metódami tradičného selektívneho skríningu, HPLC a MS je znázornený na obrázku 1. Pri podozrení na poruchu glykozylácie prvého typu (CDG I) je vhodná analýza neutrálnej frakcie N-glykánov prostredníctvom MALDI TOF MS a pri podozrení na CDG II je, naopak, naj-vhodnejším prístupom analýza sialylovaných glykánov, kde možno pozorovať prípadné defekty v konečnom procesovaní glykánov už naviazaných na vznikajúci proteín.

Výsledky a diskusia

V  predloženej práci prezentujeme dvoch vybraných slo-venských pacientov, ktorým bola diagnostikovaná CDG s nasledujúcou skrátenou epikrízou:
Pacient I  – novorodenec, respiračná insuficiencia, hy-poglykémia, trombocytopénia, hypokolaguačný stav, skele-tové abnormality, nefropatia, hepatopatia, opakujúce sa res-piračné infekcie. IEF Tf poukázala na CDG typu I. Pacient exitoval vo veku 164 dní. Sekvenovaním klinického exómu bola potvrdená homozygotná mutácia v géne ALG12, kódujúceho esenciálny enzým zúčastňujúci sa na výstavbe oligo-sacharidického prekurzora v endoplazmatickom retikule(7).
Pacient II  – vek v  čase stanovenia diagnózy 12 rokov; k dnešnému dňu v dobrom klinickom stave; pretrvávajúci hypokoagulačný stav, mierne zvýšené hladiny AST, ALT, hypocholesterolémia, hypobetalipoproteinémia. IEF Tf poukáza-la na CDG typu II. Na základe exómového sekvenovania bola u pacienta potvrdená de novo mutácia v géne SLC37A4, zod-povedná za mislokalizáciu glukóza-6-fosfátového transportéra(8).

U prezentovaných CDG I aj II pacientov bola na základe pozitívneho výsledku zo selektívneho skríningu vykonaná analýza sérových N-glykánov prostredníctvom MALDI TOF MS. V prípade pacienta I boli pozorované znížené hladiny GlcNAc-2Man8-9 (m/z 2192.2 a 2396.3). Hladina GlcNAc2Man9Glc1 (m/z 2600.6) bola u pacienta I nedetegovateľná. V prípade pacienta  II boli pozorované signifikantne zvýšené hladiny „hybridných“ štruktúr Hex6GlcNAc3NeuAc1 (m/z  2390.2), Hex5GlcNAc3NeuAc1 (m/z  2186.1), a  Hex4GlcNAc3Neu-Ac1 (m/z 1982.0). Reprezentatívne spektrá porovnané s negatívnymi kontrolami, napovedajúce o  primárnej poruche v glykozylácii, sú znázornené na obrázku 2. (GlcNAc – N-ace-tylglukozamín, Man – manóza, Glc – glukóza, NeuAc – kys. sialová).
U pacienta I signifikantný pokles hladín GlcNAc2Man8-9 vo frakcii neutrálnych sérových N-glykánov poukázal na zníženú aktivitu α-manozyltransferázy 8, kódovanej génom ALG12. Tento enzým katalyzuje pridanie ôsmeho manózové ho zvyšku na vznikajúci oligosacharid, viazaný prostredníc-tvom lipidového nosiča na membránu endoplazmatického retikula. Analýza klinického exómu prostredníctvom Clinical Exome Solution panelu sekvenovania novej generácie (z an-gl. „next generation sequencing“, NGS) identifikovala homo-zygotný variant c.1439T>C p.(Leu480Pro) v exóne 10 génu ALG12. K dnešnému dňu bolo celosvetovo identifikovaných iba 16 pacientov s týmto ochorením.
Poruchy glykozylácie druhého typu sú veľkou výzvou pre diagnostiku, pretože aberantný glykoprofil často nepoukazuje na konkrétny defekt v glykozylačnej kaskáde. Prezentované výsledky z analýzy sérových N-glykánov pacienta II, ktorého molekulárna podstata bola objasnená na zahranič-nom pracovisku(8), však na základe akumulácie aberantných hybridných štruktúr poukazujú na primárnu poruchu v glykozylácii. NGS analýza exómu poukázala na de novo mutáciu c.1267C > T (R423*) v géne SLC37A4 kódujúcom transportér glukózo6fosfátu(8). Na základe literatúry strata funkcie trans-portéra glukózo-6-fosfátu vedie k lyzozómovej poruche s názvom „Glycogen storage disorder (GSD)“ typu Ib(9), ale špecifická mutácia v tomto géne môže viesť aj k intracelulárnej mislokalizácii tohto transportéra s úplne odlišnou klinickou manifestáciou(8).
Hmotnostná spektrometria predstavuje významný prínos v diagnostike CDG prvého aj druhého typu a môže byť štandardne zavedená ako nasledujúci krok, nadväzujúci na pozitívny, respektíve hraničný výsledok selektívneho skríningu. Štruktúrna analýza predstavuje esenciálnu súčasť personalizovanej diagnostiky a aj vďaka svojej nižšej finančnej a časovej náročnosti by mala predchádzať molekulárnogenetickým analýzam (NGS). Odhaduje sa však, že pre technologickú ná-ročnosť personalizovanej diagnostiky a širokú heterogenitu klinických príznakov celosvetovo stále ostáva mnoho CDG pacientov poddiagnostikovaných. Zvýšenie povedomia laickej i odbornej verejnosti o týchto ochoreniach a spolupráca klinických a vedeckých pracovísk však môže významne prispieť k včasnému a spoľahlivému určeniu diagnózy, čo môže mať aj výrazný vplyv na kvalitu života pacientov a ich rodín.

Záver

V diagnostike zriedkavých ochorení nachádza spolupráca medzi vedeckými inštitúciami a diagnostickými pracoviskami veľké uplatnenie. Pokročilé analytické metódy ako hmotnostná spektrometria a kvapalinová chromatografia môžu byť napriek svojej technickej náročnosti optimalizované a automatizované do vysokopriepustných formátov a rozšíriť tak možnosti tzv. personalizovanej diagnostiky s individuálnym prístupom ku každému pacientovi. Práve dôkladná korelácia výsledkov štruktúrnej analýzy biomarkerov a klinických, biochemických a genetických vyšetrení môže pomôcť objasniť molekulárnu podstatu týchto raritných ochorení.

Konflikt záujmov

Autori deklarujú, že nemajú žiadny konflikt záujmov a zároveň čestne vyhlasujú, že práca nebola publikovaná v inom periodiku.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená Ministerstvom zdravotníctva SR v  rámci projektu s  registračným číslom 2019/7-CHÚSAV-4, grantom č. 2/0060/21 Slovenskej grantovej agentúry pre vedu VEGA. Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná štruktúra pre projekt: Štúdium štruktúrnych zmien komplexných glykokonjugátov v  procese dedičných metabolických a civilizačných ochorení, ITMS: 313021Y920, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja a MZ ČR-RVO-VFN64165 Autori tohto článku sú členmi Európskej referenčnej siete pre zriedkavé metabolické poruchy (European Reference Network for Rare Hereditary Metabolic Disorders, MetabERN – Project ID No 739543).

LITERATÚRA

1. Moffett S, Shiao TC, Mousavifar L, et al. Aberrant glycosylation patterns on cancer cells: Therapeutic opportunities for glycodendrimers/metallodendrimers oncology. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology 2021;13(1):e1659.

2. Shafi S, Singh A, Gupta P, et al. Deciphering the Role of Aberrant Protein Post-Translational Modification in the Pathology of Neurodegeneration. CNS Neurol Disord – Drug Targets 2021;20(1):54–67.

3. Kennedy PGE, Graner M, Pointon T, et al. Aberrant Immunoglobulin G Glycosylation in Multiple Sclerosis J Neuroimmune Pharmacol. Publikované online 03. máj 2021. doi:10.1007/s11481-021-09996-1

4. Lekka DE, Brucknerova J, Salingova A, et al. Congenital disorders of glycosylation – an umbrella term for rapidly expanding group of rare genetic metabolic disorders – importance of physical investigation. Bratislava Med J 2021;122(03):190–195.

5. Morena‐Barrio ME, Sabater M, Morena‐Barrio B, et al. ALG12‐CDG: An unusual patient without intellectual disability and facial dysmorphism, and with a novel variant. Mol Genet Genomic Med 2020;8(8):e1304.

6. Jones MA, Bhide S, Chin E, et al. Targeted polymerase chain reaction-based enrichment and next generation sequencing for diagnostic testing of congenital disorders of glycosylation. Genet Med 2011;13(11):921–932.

7. Ziburová J, Nemčovič M, Šesták S, et al. A novel homozygous mutation in the human ALG12 gene results in an aberrant profile of oligomannose N-glycans in patient’s serum. Am J Med Genet Part A 2021;185(11):3494–3501.

8. Marquardt T, Bzduch V, Hogrebe M, et al. SLC37A4-CDG: Mislocal-ization of the glucose-6-phosphate transporter to the Golgi causes a  new congenital disorder of glycosylation. Mol Genet Metab Reports 2020;25:100636.

9. Chou JY, Jun HS, Mansfield BC. Type I glycogen storage diseases: disorders of the glucose-6-phosphatase/glucose-6-phosphate transporter complexes. J Inherit Metab Dis 2015;38(3):511–519.