Pulmonary aspergillosis

Abstract:

Pulmonary aspergillosis

Pulmonary aspergillosis represents a wide range of different clinical forms of affection of the lower respiratory tract – from allergic symptoms to life-threatening infections in high-risk patients. There are various classifications of pulmonary aspergillosis, however, four main forms are distinguished:  invasive pulmonary aspergillosis, chronic necrotizing pulmonary aspergillosis, pulmonary aspergilloma and allergic bronchopulmonary aspergillosis. Causative agent of the disease are ubiquitous filamentous fungi of the genus Aspergillus. The author presents an overview of clinical forms of pulmonary aspergillosis and possibilities of their laboratory diagnosing.

 

Key words: pulmonary aspergillosis, Aspergillus fumigatus, invasive pulmonary aspergillosis, chronic necrotizing pulmonary aspergillosis, aspergilloma, allergic bronchopulmonary aspergillosis, galactomannan, bronchoalveolar lavage

*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper.

 

V posledných  rokoch sa rozširuje spektrum etiologických agensov infekcií z dôvodu narastajúceho počtu imunokompromitovaných jedincov liečených agresívnymi chemoterapeutikami, a tiež vďaka zlepšujúcim sa možnostiam diagnostiky. Do popredia sa dostávajú tiež mikroskopické huby – kvasinky a vláknité huby (1, 2). Zástupcovia rodu Aspergillus  sa bežne vyskytujú v prostredí. Vstupnou bránou infekcie sú dýchacie cesty, pacient sa nakazí inhaláciou spór (konídií) (3). Konídie sa vďaka svojej malej veľkosti môžu dostať až do pľúcnych alveol, v ktorých za vhodných pod- mienok klíčia a prerastajú vo forme mycélia (spleť hýf – hubových vláken) cez okolité štruktúry, prípadne  až do krvného obehu, a tak do ďalších orgánov. Predilekčnou lokalizáciou aspergilózy sú pľúca (4). Mimopľúcna lokalizácia je vzácnejšia (paranazálne dutiny, obličky, mozog, pečeň, koža). Najčastejším pôvodcom  humánnych  aspergilóz je Aspergillus fumigatus (5), nasledovaný  druhmi  A. flavus, A. niger a A. terreus  (6, 7).

 

Formy pľúcnej aspergilózy

Invazívna pľúcna aspergilóza (IPA)

Táto najzávažnejšia forma pľúcnej aspergilóz y (PA) sa v ysk y tuje predovšetkým  u výrazne imunitne oslabených jedincov. Letalita IPA sa pohybuje od 50 % až do 90 % (5). Najviac ohrození  sú pacienti s dlhodobou neutropéniou, akútnou leukémiou, po transplantácii krvotvorných buniek a orgánov (srdce, pľúca, pečeň, obličky), dlhodobo liečení kor tikosteroidmi alebo imunosupresívami  (7, 8). V klinickom obraze dominuje  horúčka,  neproduktívny  dráždiv ý kašeľ, dyspnoe, pleurálna bolesť, pleurálny trecí šelest (8, 9). Následkom  angioinvazivity je hemoptýza, pri masívnejšom postihnutí vznikajú kavitácie. Môže dôjsť k diseminácii  – najmä do CNS (centrálny nervový systém), čo sa spája s veľmi nepriaznivou prognózou  (3). V závažných prípadoch pribúdajú známky konsolidácie pľúc, tachypnoe, progresívne sa zhoršujúca hypoxémia až respiračné zlyhanie. Na úspešné zvládnutie IPA je nevyhnutné včasné stanovenie diagnózy a najmä podávanie účinnej antimykotickej (ATM) liečby (7, 9). V súčasnosti  je liekom voľby vorikonazol, v druhej línii lipidový komplex  amfotericínu  B, posakonazol  alebo kaspofungín (8). Niekedy je potrebná aj chirurgická intervencia (6).

 

Chronická nekrotizujúca pľúcna aspergilóza (CNPA)

Táto vzácna chronická infekcia je takmer vždy spôsobená druhom A. fumigatus (5). Ide o lokálnu inváziu hýf do pľúcneho parenchýmu, bez angioinvazivity a diseminácie do iných orgánov, pri ktorej dochádza k nekrózam a zápalu. CNPA sa vyskytuje najmä  u starších pacientov s chronickými pľúcnymi ochoreniami (chronická obštrukčná pľúcna choroba, pľúcna tuberkulóza, pneumokonióza,  cystická fibróza, sarkoidóza, pľúcny infarkt) a nezriedka aj s miernym imunodeficitom či chronickým alkoholizmom (3).

 

Pľúcny aspergilóm

Aspergilóm (mycetóm)  je guľovitý útvar tvorený masou hýf, hlienu, fibrínu a leukocytov. Vytvára sa v preexistujúcej dutine pľúcneho  parenchýmu. Najčastejšou  príčinou  vzniku týchto dutín je tuberkulóza, sarkoidóza, iný nekrotizujúci pľúcny proces (absces, iné pľúcne infekcie), cystická fibróza alebo nádor (3, 5). Aspergilóm  len zriedkavo mení svoju veľkosť a pri poškodení ciev v bezprostrednej blízkosti môže spôsobiť krvácanie. Definitívnou liečbou je chirurgické riešenie – resekcia aspergilómu alebo cielená embolizácia vyživovacej bronchiálnej artérie.

 

Alergická bronchopulmonálna aspergilóza (ABPA)

Táto forma aspergilózy sa vyskytuje predovšetkým u pacientov s prieduškovou astmou alebo cystickou fibrózou a výrazne zhoršuje priebeh týchto ochorení  (3). ABPA predstavuje hypersenzitívnu  reakciu na kolonizáciu dýchacích ciest Aspergillus spp. Dochádza k upchatiu dýchacích ciest zhlukom  hlienu,  hýf, zápalových  buniek, bez poškodzovania pľúcneho tkaniva (5). Priebeh  ochorenia  je možné liečebne ovplyvniť celkovými kortikoidmi a v niektorých prípadoch pridaním ATM (3).

 

Diagnostika pľ úcnej aspergilózy

Diagnostika pľúcnej  aspergilózy je interdisciplinárny proces. Opiera sa o klinický obraz, zobrazovacie metódy a laboratórne vyšetrenia. HRCT (high-resolution computed tomography – počítačová tomografia s vysokým rozlíšením) má v porovnaní s klasickým RTG vyšetrením oveľa väčší prínos v diagnostike. Pri IPA sa stretávame  s rôznorodými nálezmi – mnohopočetné  ložiská, kavitácie, pleurálny  výpotok, „ground glass opacity“ (obraz mliečneho skla), halo sign“ (prekrvácanie  na periférii centrálnej kondenzácie) alebo air crescent sign“ (rozpadová dutina).

Ďalším krokom by mali byť mikrobiologické analýzy: stanovenie galaktomanánu (GM) v BAL (bronchoalveolárna laváž) a krvnom sére, mikroskopická a kultivačná analýza BAL (9, 10, 11, 12, 13).

Mozaiku vyšetrení môže doplniť dôkaz DNA (deoxyribonucleic aci− deoxyribonukleová kyselina) Aspergillus  spp. metódou PCR (polymerase chain reaction – polymerázová reťazová reakcia) vo vzorkách BAL, krvi a iných primárne sterilných biologických  materiáloch (8, 9, 10). Nápomocnou metódou je tiež detekcia 1,3-β-D-glukánu (BDG), najmä vo vzorkách krvného séra (výnimočne aj v BAL). Jednou z možností je histologické vyšetrenie vzoriek získaných biopsiou pľúcnych infiltrátov, avšak pre vysoké riziko komplikácií a častú kontraindikáciu výkonu sa táto možnosť širšie nevyužíva.

 

Mikrobiologická diagnostika PA

Pri podozrení  na pľúcnu aspergilózu sa odporúča  zaslať biologický materiál cielene  do mykologického laboratória. Medzi  diagnosticky najprínosnejšie vzorky patrí BAL, bioptická vzorka pľúc, krvné sérum, punktáty z primárne sterilných lokalít a pri podozrení na disemináciu do CNS aj likvor. Menej vhodným materiálom je odsatý sekrét (OS) z dolných dýchacích ciest (DDC) alebo spútum. Pozitívny nález v týchto biologických materiáloch môže byť spôsobený kolonizáciou dýchacích ciest.

Mikroskopia je časovo nenáročná, ale vyžaduje si skúsenosť mykológa (1, 9). Prítomnosť  hýf v biologickom  materiáli z DDC zvyšuje pravdepodobnosť možnej pľúcnej aspergilózy. Senzitivita mikroskopie síce výrazne kolíše (0 % až 90 %) (10), ale prítomnosť elementov mikroskopických húb vo vzorke môže  klinikov nasmerovať  k mykotickej etiológii infekcie. Nevýhodou  tejto analýzy okrem  nízkej senzitivity je, že neumožňuje identifikovať pôvodcu  do rodu a druhu. Hýfy Aspergillus spp. sa nedajú spoľahlivo odlíšiť od hýf niektorých ďalších rodov mikromycét  (9, 10, 13).

Kultivácia vláknitých húb je časovo náročná (2 až 14 dní), avšak pozitívny nález umožňuje určiť možného pôvodcu infekcie (1, 2). Nevýhodou kultivácie je okrem dĺžky jej trvania tiež nízka senzitivita – okolo 50 % (9), čo môže súvisieť s predošlou ATM liečbou pacienta a faktom, že elementy mikroskopických húb nemusia byť vo vzorke rovnomerne rozptýlené. Pokiaľ sa Aspergillus sp. vykultivuje z bioptickej vzorky tkaniva, diagnóza aspergilózy  je potvrdená  (10). Základným  kultivačným  médiom  je Sabouraudov  glukózový agar. Z narastenej kultúry (obrázok 1) sa zhotoví preparát, napríklad v laktofenole s bavlníkovou  modrou  (obrázok  2). Na základe makro- a mikromorfológie sa izolát identifikuje na úroveň druhu (respektíve sekcie alebo len rodu). Kvantitatívna citlivosť kmeňa na ATM sa stanovuje formou E-testu. Výsledkom je číselný údaj v jednotke mg/l, ktorý predstavuje hodnotu MIC (minimum inhibitory concentration – minimálna inhibičná koncentrácia) daného ATM pre konkrétny izolát Aspergillus  sp. (obrázok 3). Štandardnou  pôdou  na stanovenie citlivosti vláknitých húb na ATM je RPMI médium (Roswell Park Memorial  Institute medium). Podľa Vestníka Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky z roku 2010 sa odporúča  stanovovať citlivosť na vorikonazol, amfotericín B, posakonazol, kaspofungín a itrakonazol (14).

Stanovenie GM v BAL a kr vnom sére metódou  ELISA (enz ymelinked immunosorbent assay – imunoenz ymatická analýza na dôkaz antigénov alebo protilátok) sa stalo jedným z kľúčových laboratórnych vyšetrení pri podozrení na IPA (7, 15). Tento antigén sa uvoľňuje z bunkovej steny niektorých mikroskopických húb (vrátane druhov rodu Aspergillus) počas ich rastu. Množstvo  GM vo vzorke sa vyjadruje pomocou indexu pozitivit y (IP), ktorý má rôzne hraničné hodnoty (cutof f ) v biologick ých materiáloch BAL a sérum. Vo vzorkách BAL je cutoff  IP = 1,0 (11, 15). V krvnom sére je GM negatívny  pri IP < 0,5; slabo pozitívny od IP ≥ 0,5 až do < 0,7 a pozitívny  pri IP ≥ 0,7. Nález  IP GM ≥ 0,5 v dvoch za sebou nasledujúcich  vzorkách je mikrobiologickým kritériom pre pravdepodobnú aspergilózu (9). Pri detekcii GM je často pozorovaná skrížená (falošná) pozitivita. Je opisovaná pri systémových infekciách vyvolaných inými rodmi mikroskopick ých húb (Penicillium spp., Paecilomyces  spp., Alternaria spp., Rhodotorula  spp., Histoplasma capsulatum), liečbe pacientov niek tor ými betalak támovými antibiotikami (ampicilín,  ampicilín/sulbak tám,  piperacilín/tazobak tám, amoxicilín/  klavulanát), kolonizácii črevnej sliznice Bifidobacterium spp.  u novorodencov  (najmä nedonosených),  prieniku GM z niektorých mliečnych výrobkov cez poškodenú stenu gastrointestinálneho traktu (mukozitída pri črevnej GvHD, graftversus-host disease – reakcia štepu voči hostiteľovi po transplantácii), aplikácii roztoku Plasmalyte®, kontaminácii vzorky počas odberu alebo pri spracovaní materiálu (vata, vzdušné konídie Aspergillus  spp., Penicillium spp.) (9, 10, 16). Pozitivita GM v BAL pri pľúcnej aspergilóze môže časovo predchádzať  jeho pozitivitu v krvnom sére (9), preto  sa pri podozrení  na IPA odporúča včas odobrať BAL na stanovenie GM. Výhodou vyšetrenia hladiny GM (predovšetkým v BAL) je jeho vysoká senzitivita a špecifickosť (61 % až 94 % a 71 % až 92 %) (10), ako aj negatívna  prediktívna hodnota  (92 % až 98 %) (5), pričom  vyššie hodnoty sa zaznamenali pri vyšetrení BAL (10). Monitorovanie  hodnôt  IP GM je jedným  z ukazovateľov úspešnosti ATM liečby pacienta s IPA.

 

Protilátky voči A. fumigatus sa stanovujú z krvného  séra, napríklad nepriamou hemaglutináciou  (celkové protilátky) alebo metódou  ELISA– špecifické protilátky tried IgA, IgM a IgG, respektíve  IgE. Pri nepriamej hemaglutinačnej metóde sa ako hraničný titer protilátok udáva hodnota 1 : 320.  V takom prípade sa odporúča  opakovať vyšetrenie s odstupom 2 až 3 týždňov. Signifikantnú reakciu v zmysle aspergilózy predstavuje  titer ≥ 1 :  640.  Výhodou týchto sérologick ých analýz je využitie ich stanovenia  pri diagnostike ABPA,  CNPA alebo pľúcneho aspergilómu.

Pri diagnostike  IPA je možné využiť aj stanovenie  BDG (9, 10, 17). Tento antigén sa uvoľňuje do krvného obehu pri aktívne prebiehajúcej systémovej mykóze, a to nielen pri aspergilóze, ale aj pri infekcii vyvolanej inými mikroskopickými hubami  – s výnimkou mukormycét  a druhov rodu Cryptococcus  (9). Nižšia špecifickosť  (76 %) je jednou  z nevýhod tohto laboratórneho testu (15). Falošne pozitívny nález bol pozorovaný u pacientov liečených niektorými antibiotikami (amoxicilín/klavulanát, imipeném, gentamicín), pri dialýze s použitím celulózovej membrány, kontaminácii gázou, bakteriálnej sepse alebo laboratórnej kontaminá- cii (9). Silnou  stránkou  tejto  metódy  je vysoká negatívna  prediktívna hodnota  (94 %) (15).

Metódy molekulárnej biológie sa využívajú čoraz častejšie. Pri podozrení na IPA sa stanovuje prítomnosť DNA Aspergillus spp. v biologických vzorkách PCR analýzami. K dispozícii je niekoľko komerčných  súprav na rôzne typy PCR reakcií a podľa viacerých štúdií sa dosahujú dobré výsledky z hľadiska senzitivity (70 % až 91 %), špecifickosti (97 % až 100 %), pozitívnej (100 %) a negatívnej prediktívnej hodnoty  (93 %) (10, 15). Stále však chýba štandardizácia týchto analýz pre rutinné laboratórne vyšetrenie. Pozitívny PCR nález u imunokompromitovaného  symptomatického pacienta má vysokú diagnostickú hodnotu. Molekulárno-biologické stanovenia sú však vysoko senzitívne, preto môže ľahko dôjsť k falošne pozitívnym výsledkom, napríklad pri kontaminácii vzorky konídiami Aspergillus  spp. z prostredia alebo pri kolonizácii DDC.

Interpretácia výsledkov mykologických vyšetrení je náročná a odporúča sa podľa možnosti potvrdiť nález opakovaným vyšetrením.

Odber a transport biologického materiálu

Biologický materiál je potrebné odoberať asepticky do sterilných uzatvárateľných odberových nádob a po odbere ich už neotvárať. Všeobecne platí, že materiál by mal by ť doručený do laboratória čo najskôr po odbere – pri diagnostike  PA cielene na oddelenie mykológie. Rovnako dôležité je správne a čitateľne vyplniť mikrobiologickú (mykologickú) žiadanku vrátane uvedenia adekvátnej diagnózy. Identifikačné údaje pacienta  (meno,  rodné číslo), typ materiálu a požadovaných  analýz je potrebné  zaznačiť aj na odberovej nádobe (skúmavke, tampóne).

Materiál získaný pri bronchoskopii  (BAL) a bioptické vzorky sa uscho- vávajú v sterilnom fyziologickom roztoku. Spútum sa odoberá ráno pri prvej expektorácii po vypláchnutí ústnej dutiny čistou pitnou vodou.

Na stanovenie sérového GM a protilátok voči A. fumigatus  sa odoberá krv do skúmavky s gélom (respektíve do skúmavky bez protizrážavého činidla) s objemom  minimálne 2 až 3 ml. Pri možnosti  transportu materiálu do 2 hodín od odberu sa môže skladovať pri izbovej teplote (+18 °C až +25 °C). Ak je predpokladaná lehota doručenia vzorky 2 až 24 hodín, je potrebné  uschovať  ju pri teplote +2 °C až +8 °C. Pri dlhšom skladovaní je potrebné oddeliť krvné sérum (v laminárnom boxe, aby sa minimalizovalo  riziko kontaminácie  vzorky) a zamraziť ho na -18 °C až -24 °C.

Kultivácia spolu s mikroskopiou (pri požiadavke na kultivačné vyšetrenie sa vykonáva automaticky) biologického materiálu sa realizuje denne. GM a celkové protilátky voči A. fumigatus sa vyšetrujú t. č. 2-krát týždenne (utorky a piatky), pričom materiál musí byť doručený  do laboratória najneskôr deň vopred.

Stanovenie sérového galaktomanánu a protilátok voči A. fumigatus je určené hospitalizovaným pacientom, rovnako aj pacientom z hematoonkologických, imunoalergologických  a pneumologických  ambulancií pri podozrení na niektorú z foriem pľúcnej aspergilózy. U ostatných ambulantných pacientov sa tieto analýzy poskytujú na priamu platbu (cenník dostupný na webovom rozhraní laboratórií).

 

Záver

Pľúcna aspergilóza si vyžaduje náležitú pozornosť pre svoj rôznorodý klinický obraz, problematickú diagnostiku a v mnohých prípadoch aj nepriaznivú  prognózu. Základom úspešnej laboratórnej diagnostiky IPA je včasné  rozpoznanie jej hrozby  na základe rizikových faktorov pacienta, nešpecifických klinických príznakov a s pomocou ďalších vyšetrovacích  metód (9, 15).  Výsledky jednotlivých laboratórnych vyšetrení je potrebné  interpretovať  v súlade s klinickým stavom pacienta, ako aj výsledkami zobrazovacích metód, čo predpokladá úzku spoluprácu  ošetrujúcich  lekárov a mikrobiológov  pri manažmente pacienta s pľúcnou aspergilózou.

 

Literatúra

1. Buchta V, Hamal P, Mallátová  N, et al. Nepodkročitelné minimum laboratorní diagnostiky invazívních mykotických infekcí – doporučení odborníků s podporou CELL a SLM JEP. Postgraduální medicína. 2010;12(příloha 5):76–81.

2. Tošková M, Winterová J, Kocmanová I, et al. Invazívne mykotické infekcie u hematoonkologických pacientov – epidemiológia, rizikové faktory, klinické príznaky a diagnostika. Onko- logie. 2012;6(6):298–303

3. Harman EM. Aspergillosis [online]. Updated 2015. Available from: <http://emedicine.medscape.com/article/296052-overview>. Accessed December 28, 2015

4. De Hoog GS, Guarro J, Gené J, et al. Atlas of Clinical Fungi. 2nd ed. Utrecht, The Netherlands/ Reus, Spain: Centraalbureau voor Schimmelcultures/Universitat Rovira i Virgili; 2000: 1126

5. Kousha M, Tadi R, Soubani AO. Pulmonary aspergillosis: a clinical review. Eur Respir Rev. 2011;20(121):156–174.

6. Drgoňa Ľ. Invazívne mykotické  infekci In: Drgoňa  Ľ. Infekčné komplikácie onkologických pacientov. Bratislava, Slovenská republika: Univerzita Komenského; 2013: 24–42.

7. Gašpar M, Drgoňa Ľ, Pőczová M, et al. Včasná invazívna pľúcna aspergilóza s fatálnym koncom u pacientky s akútnou lymfoblastovou leukémiou. Onkológia (Bratisl.). 2015;10(2):116–120.

8. Sherif R, Segal BH. Pulmonary Aspergillosis: clinical presentation, diagnostic tests, management and complications. Curr Opin Pulm Med. 2010 May;16(3):242–250.

9. The Czech Leukemia Study Group for Life (Česká leukemická skupina – pro život) – Ráčil Z, Mayer J, eds. Invazivní aspergilóza: současné možnosti diagnostiky. Vnitř. Lék. 2007;53(Suppl):S1–S34.

10. Barton RC. Laboratory Diagnosis of Invasive Aspergillosis: From Diagnosis to Prediction of Outcom Scientifica. 2013;Article ID 459405:29.

11. Haber Hodnocení galaktomananu v séru a bronchoalveolární laváži u neutropenických a non-neutropenických pacientů. Kazuistiky v alergologii, pneumologii a ORL. 2011;8(2):10–13.

12. Sharma SK, Kumar S, Singh  AK, et al. Feasibility  and outcome  of CT-guided lung biopsy in patients with hematological  diseases and suspected  fungal pneumonia. J Infect Dev Ctries. 2013;7(10):748–752.

13. Crumley S, Hull A, Cernoch P, et al. Comparison between cytologic examination of fungi in bronchial washings and bronchoalveolar lavage specimens and culture: a review of 100 cases with emphasis  on diagnostic  pitfalls. Journal of the American Society of Cytopathology. 2014;3(4):211–217.

14. Odborné usmernenie Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky k diagnostike a liečbe invazívnych mykóz. In: Vestník Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky. Bratislava, Slovenská republika: V OBZOR, s. r. o.; 2010: 146–159.

15. Hoenigl M, Prattes J, Spiess B, et al. Performance of Galactomannan, Beta-D-Glucan, Aspergillus Lateral-Flow Device, Conventional Culture, and PCR Tests with Bronchoalveolar Lavage Fluid for Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis. J Clin Microbiol. 2014;52(6):2039–2045.

16. Wheat LJ, Walsh TJ. Diagnosis  of invasive aspergillosis  by galactomannan antigenemia detection using an enzyme immunoassay. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2008;27(4):245–251.

17. Racil Z, Kocmanova I, Lengerova M, et al. Difficulties in using 1,3-β-D-glucan as the screening test for the early diagnosis of invasive fungal infections in patients with haematological malignancies – high frequency  of falsepositive results and their analysis. J Med Microbiol. 2010;59(9):1016–1022.