*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf attachment at the end of the paper.
Úvod
Zhubné nádory hrubého čreva patria medzi najpočetnejšie malígne ochorenia vo vyspelých štátoch sveta. Slovenská republika sa nachádza na jednom z popredných miest v celosvetovom rebríčku, v Európe má po Maďarsku a Nórsku tretiu najvyššiu incidenciu a je na prvom mieste v mortalite na kolorektálny karcinóm(1). Na vzniku kolorektálneho karcinómu sa podieľajú environmentálne aj genetické faktory. Nádorová transformácia je výsledkom postupného hromadenia genetických a epigenetických zmien, ktoré vedú k transformácii povrchového epitelu hrubého čreva a ovplyvňujú jeho biologické správanie vrátane malígneho potenciálu. Solídne tumory vrátane nádorov hrubého čreva sú často infiltrované bunkami imunitného systému. Za spúšťanie imunitnej
odpovede zodpovedajú aj antigény vzniknuté v procese nádorovej transformácie hromadením bunkových mutácií, tzv. nádorové neoantigény. Vplyv protinádorového imunitného
mikroprostredia na prognózu nádorov je v súčasnosti predmetom štúdia mnohých vedeckých prác. Ukazuje sa, že práve mikroprostredie transformovaných nádorových buniek má význam ako prognostický faktor a podieľa sa na karcinogenéze, a to v štádiu iniciácie aj progresie nádorového rastu(2,3).
Za normálnych okolností sa imunitný systém snaží potlačiť nádorovú progresiu buď zničením nádorových buniek, alebo inhibíciou ich rastu. Na druhej strane môže imunitný
systém podporiť aj nádorovú progresiu vyselektovaním rezistentných nádorových buniek alebo sa paradoxne podieľa na vytvorení imunosupresívného nádorového mikroprostredia.
Práve schopnosť nádorových buniek kontrolovať imunitný systém a vznik imunitnej rezistencie umožňuje nádorovým bunkám uniknúť spod kontroly a podieľa sa na progresii
nádorovej choroby(2,4). Cieľom predloženej štúdie je zhodnotiť aktiváciu imunitného systému v nádoroch hrubého čreva v závislosti od stupňa diferenciácie nádoru a v porovnaní s okolitým nádorovo nepostihnutým tkanivom hrubého čreva.
Materiály a metódy
Analyzovali sme archívne tkanivové vzorky nádorov hrubého čreva fixované formalínom a zaliate v parafíne, pochádzajúce z terapeutických a diagnostických bioptických odberov
a archivované v Ústave patologickej anatómie LF UK v Bratislave. Vzorky boli histopatologicky posúdené a bola stanovená patologická diagnóza v zmysle platných kritérií WHO.
Základný súbor tvorilo 23 prípadov kolorektálneho karcinómu, z toho 4 prípady dobre diferencovaného (G1), 12 prípadov stredne diferencovaného (G2) a 3 prípady nízkodiferencovaného (G3) adenokarcinómu a 4 prípady hlienotvorného adenokarcinómu. Samostatne sme hodnotili miesta s nádorovým rastom a okolité tkanivo nepostihnuté nádorom.
Hodnotili sme infiltráciu tkaniva zápalovými bunkami so zameraním na cytotoxické T-lymfocyty (CD8+), pomocné T-lymfocyty (CD4+) a histiocyty (CD68+). Ich prítomnosť bola hodnotená
imunohistochemicky; v krátkosti odparafínované preparáty boli prepláchnuté 5 minút v PBS (vo fyziologickom soľnom roztoku pufrovanom fosfátmi s 10 mM, pH 7,4). Tkanivové epitopy boli následne demaskované procesom revitalizácie s použitím Dako PT Link (Agilent, Santa Clara, CA, USA); rezy boli inkubované v roztoku TRIS-EDTA (10 mM TRIS, 1 mM
EDTA pH 9) pri teplote 98 °C počas 20 minút. Preparáty boli následne inkubované 60 minút s myšacou monoklonálnou protilátkou proti CD8 (ready to use, Agilent, Santa Clara, CA,
USA), proti CD4 (ready to use, DAKO, Carpinteria, USA) a proti CD68 (ready to use, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Po 3-násobnom prepláchnutí v PBS, boli preparáty inkubované 30 minút s polymérom Histofine proti myšacím proteínom (Nichirei Biosciences, Japonsko) a po opakovanom 3-násobnom prepláchnutí v roztoku PBS farbené 5 minút diaminobenzidínom
(DAB+, DAKO, Carpinteria, USA). Preparáty boli následne krátko dofarbené hematoxylínom, aby sa zvýraznili jadrá buniek. Preparáty boli hodnotené vo svetelnom mikroskope. Miera
infiltrácie tkaniva zápalovými bunkami s príslušným fenotypom bola hodnotená kvantitatívne v 3 náhodných poliach s použitím histomorfometrického softvéru ImageJ, v. 1,51 g(5) a vyjadrená ako percento proti celkovej ploche. Výsledky boli vyhodnotené štatisticky použitím štatistického softvéru Graph Pad Prism s použitím one-way ANOVA testu s následným Turkey post-testom, hodnoty p < 0,05 boli považované za signifikantné.
Výsledky
V nádoroch hrubého čreva aj v okolitom nepostihnutom tkanive pozorujeme prítomnosť CD8+ cytotoxických T-lymfocytov, CD4+ pomocných T-lymfocytov (obrázok 1) aj CD68+ histiocytov (obrázok 2), s dominanciou CD68+ buniek. So stúpajúcim gradingom nádoru sme v našom súbore pozorovali signifikantný pokles CD4+ (1,6 ± 0,43 % v G1 verzus 0,33 ± 0,08 % v G2, verzus
0,42 ± 0,17 % v G3, G1/G2 p < 0,001, G1/G3 p < 0,05) aj pokles CD8+ cytotoxických T-lymfocytov (3,1 ± 0,38 % v G1 verzus 1,7 ± 0,3 % v G2 verzus 0,61 ± 0,14 % v G3, G1/G2 p < 0,05, G1/ G3 p < 0,01). Pokles CD68+ histiocytov (5,3 ± 0,46 % v G1 verzus 4,1 ± 0,51 % v G2 verzus 3,44 ± 0,67 % v G3, G1/G2 p = 0,05) bol na hranici signifikantnosti (graf 1). Nepozorovali sme žiadne zmeny v podiele jednotlivých typov lymfocytov v okolitom tkanive nepostihnutom nádorom (graf 2). Nepozorovali sme odlišný profil zápalových buniek v súvislosti s mucinóznou diferenciáciou nádoru, tá dosahovala úroveň približne rovnakú ako nádory so strednou diferenciáciou (G2).
Diskusia
Kolorektálny adenokarcinóm patrí medzi najčastejšie sa vyskytujúce gastrointestinálne malignity s vysokou mortalitou napriek dostupnej liečbe. Ukazuje sa, že samotný staging založený na TNM klasifikácii kolorektálneho karcinómu nie je dostatočne presný z hľadiska predikcie prognózy pri všetkých štádiách choroby(6). Súčasný výskum vedie k hľadaniu prognostických markerov, ktoré by lepšie stratifikovali pacientov. Prospešné by mohlo byť aj hodnotenie pacientov založené na imunologickom profile nádorového mikroprostredia(7).
Počet vedeckých dôkazov podporujúcich význam imunitnej odpovede pri nádorových chorobách neustále rastie(3). Súčasné terapeutické metódy používané v liečbe kolorektálneho
karcinómu (cytotoxická chemoterapia, anti-EGFR protilátky, anti-angiogénne molekuly) čiastočne súvisia s imunomodulujúcimi mechanizmami a imunoterapia preukázala svoj potenciál aj v prípadoch, keď zlyháva klasická liečba(8-10). Kolorektálny karcinóm je známy tvorbou vysokoimunogénnych nádorových neoantigénov a je sprevádzaný zvýšenou infiltráciou tkaniva zápalovými bunkami, ktorú sme pozorovali aj v našej štúdii. Tento mechanizmus je mimoriadne zaujímavý najmä v prípade nádorov s mikrosatelitovou instabilitou (MSI), kde vznikajú presne definované nádorové neoantigény v dôsledku známych molekulárnych dráh zasiahnutých mutáciou (tzv. frameshift peptidy)(11). Lymfocyty infiltrujúce tumor (TIL) a makrofágy asociované s nádorom (TAM) sú lokalizované v zápalovom infiltráte okolo nádorových ostrovčekov a taktiež v perinádorovej. TAM patria medzi dominantné zápalové bunky v nádorovej stróme. Správajú sa ako modulátory mikroprostredia pomocou vylučovania cytokínov, chemokínov, rastových faktorov a angiogénnych faktorov(12). To súhlasí aj s dominanciou CD68+ zápalových buniek v nádorovom tkanive nami pozorovanou.
Úloha TAM v nádore je dvojitá. TAM môžeme deliť do dvoch podskupín: M1 makrofágy zabezpečujú protinádorovú odpoveď a cytotoxicitu a M2 makrofágy, ktoré, naopak, potlačením protinádorovej imunitnej odpovede podporujú nádorovú progresiu(13,14). Z TIL majú kľúčovú úlohu cytotoxické T-lymfocyty CD8+, ktoré môžu rozpoznať nádorové antigény prezentované APC bunkami. Cytotoxické T-lymfocyty sa následne aktivujú pomocou kostimulátorových molekúl a synetizujú a vylučujú cytotoxické proteíny podieľajúce sa na priamej deštrukcii nádorových buniek. Vysoká hustota CD8+ lymfocytov v nádorovom tkanive je spojená s lepšou prognózou choroby(12). Je zaujímavé, že v našom súbore sme pozorovali pokles CD8+ lymfocytov aj ostatných pozorovaných zápalových buniek v závislosti od rastúceho gradingu a stúpajúcej agresivity tumoru. Môže to podporovať predstavu o imunosupresívnom pôsobení nádorového mikroprostredia(4), ktoré môže byť dôležitým faktorom progresie choroby aj pri vzniku vzdialených metastáz(15). Viaceré štúdie preukázali, že imunitná odpoveď koreluje s lepším prežívaním pacientov s kolorektálnym karcinómom(16,17). Predložená štúdia naznačuje, že v súvislosti so zvyšujúcim sa gradingom nádoru dochádza k poklesu intenzity protinádorovej imunitnej odpovede. Tento pokles môže byť následkom, ale aj príčinou progresie tumoru. Práve ovplyvnenie protinádorovej imunitnej odpovede môže predstavovať potenciálne
zaujímavý terapeutický prístup.
Poďakovanie: Štúdia bola realizovaná s podporou projektuAPVV-14-0318 „Analýza mikroRNA a charakterizácia expresie vybraných proteínov v cirkadiánnom kontexte ako prognostický
biomarker pre kolorektálny karcinóm“. Štúdia bola parciálne realizovaná ako súčasť práce výskumného centra vybudovaného vďaka podpore v rámci OP Výskum a vývoj preprojekt: „Dobudovanie multidisciplinárneho centra pre biomedicínsky výskum – BIOMEDIRES“, ITMS 26210120041, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
LITERATÚRA
1. ECIS – European Cancer Information System. 2019; European Union.
2. Curtis NJ, Primrose JN, Thomas GJ, et al. The adaptive immune response to colorectal cancer: from the laboratory to clinical practice. Eur J Surg Oncol 2012; 38(10): 889-96.
3. de la Cruz-Merino L, Henao Carrasco F, Vicente Baz D, et al. Immune microenvironment in colorectal cancer: a new hallmark to change old paradigms. Clin Dev Immunol 2011; 2011: 174149.
4. Naidoo J, Page DB, Wolchok JD. Immune modulation for cancer therapy. Br J Cancer 2014; 111(12): 2214-9.
5. Abramoff MD, Magelhaes PJ, Ram SJ. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International 2004; 11(7): 36-42.
6. Liu Q, Luo D, Cai S, et al. P-TNM staging system for colon cancer: combination of P-stage and AJCC TNM staging system for improving prognostic prediction and clinical management. Cancer Manag Res 2018; 10: 2303‑2314.
7. Nearchou A, Pentheroudakis G. The significance of tumor-associated immune response in molecular taxonomy, prognosis and therapy of colorectal cancer patients. Ann Transl Med 2016; 4(14): 271.
8. Pernot S, Terme M, Voron T, et al. Colorectal cancer and immunity: what we know and perspectives. World J Gastroenterol 2014; 20(14): 3738-50.
9. Llosa NJ, Cruise M, Tam A, et al. The vigorous immune microenvironment of microsatellite instable colon cancer is balanced by multiple counter- inhibitory checkpoints. Cancer Discov 2015; 5(1): 43-51.
10. Brahmer JR, Drake CG, Wollner I, et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J Clin Oncol 2010; 28(19): 3167-75.
11. Kloor M, von Knebel Doeberitz M. The Immune Biology of Microsatellite-Unstable Cancer. Trends in Cancer 2016; 2(3): 121-133.
12. Colangelo T, Polcaro G, Muccillo L, et al. Friend or foe? The tumour microenvironment dilemma in colorectal cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer 2017; 1867(1): 1-18.
13. Mantovani A, Marchesi F, Malesci A, et al. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol 2017.
14. Grizzi F, Basso G, Borroni EM, et al. Evolving notions on immune response in colorectal cancer and their implications for biomarker development. Inflamm Res 2018; 67(5): 375-389.
15. Donahue T, Lee CY, Sanghvi A, et al. Immunosuppression is an independent prognostic factor associated with aggressive tumor behavior in cutaneous melanoma. J Am Acad Dermatol 2015; 73(3): 461-6.
16. Ogino S, Nosho K, Irahara N, et al. Lymphocytic reaction to colorectal cancer is associated with longer survival, independent of lymph node count, microsatellite instability, and CpG island methylator phenotype. Clin Cancer Res 2009; 15(20): 6412-20.
17. Sinicrope FA, Rego RL, Ansell SM, et al. Intraepithelial effector (CD3+)/ regulatory (FoxP3+) T-cell ratio predicts a clinical outcome of human colon carcinoma. Gastroenterology 2009; 137(4): 1270-9.
