*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
 attachment at the end of the paper. 

Úvod
S. pneumoniae je baktéria ktorá často osídľuje sliznice horných dýchacích ciest. Z asymptomatickej kolonizácie sa však môže vyvinúť ochorenie dýchacích ciest ale aj invazívna infekcia. Nazofaryngálne nosičstvo pneumokokov je častejšie u malých detí, ktoré sú rezervoárom a vektorom tejto
baktérie pri jej horizontálnom šírení v komunite. Kolonizácia sliznice nazofaryngu potenciálne patogénnymi baktériami je dynamický proces ovplyvnený najmä stavom lokálnej slizničnej imunity, ale je podmienený aj vekom, genetickými a socioekonomickými faktormi. Nosičstvo pneumokokov v ekonomicky
vyspelých štátoch rastie s vekom. Vo Fínsku Syrjanen a kol.(1) zaznamenali výskyt S. pneumoniae u 13 % detí do 6 mesiacov a u 43 % detí vo veku nad 19 mesiacov. Zo socioekonomických a environmentálnych faktorov na frekvenciu kolonizácie vplýva najmä veľkosť rodiny, počet súrodencov, príjem rodiny, fajčenie a užívanie antibiotík. Pri kolonizácii má dôležitú úlohu ekosystém sliznice a vzájomné interakcie medzi
mikroorganizmami na sliznici horných dýchacích ciest(2). Je známe, že vírusová infekcia zvyšuje predispozíciu na bakteriálnu superinfekciu napr. pri chrípke býva ťažkou komplikáciou pneumokoková pneumónia(3). Nielen pri chrípke, ale všeobecne pri infekciách spôsobených respiračnými vírusmi, ako napr. rinovírus, metapneumovírus, RSV, adenovírus, koronavírusy je vyššia predispozícia k bakteriálnej superinfekcii v dôsledku narušenia epitelovej bariéry vírusom, pre zvýšenie expresie adhezívnych proteínov viažucich potenciálne patogénne baktérie, a pre narušenie funkcie neutrofilov, NK buniek a monocytov(3). Interakcie medzi najčastejšími podmienenými patogénmi kolonizujúcimi horné dýchacie cesty
S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis a Staphylococcus aureus boli dokázané aj v experimentálnych podmienkach(4). S. pneumoniae je mohutným producentom peroxidu vodíka. Ten pôsobí baktericídne aj na baktérie produkujúce katalázu (S. aureus, H. influenzae), enzým, ktorý
rozkladá peroxid vodíka(5,6). Iným mechanizmom vzájomnej interferencie medzi S. pneumoniae a H. influenzae je pôsobenie pneumokokovej neuraminidázy na povrchové sialové kyseliny H. influenzae, čím sa zabráni adherencii hemofila k sliznici(7). Pravdepodobne najpriaznivejšie vzťahy sú medzi S. pneumoniae a M. catarrhalis. Perez a kol. v roku 2014(8) v štúdii vzťahov S. pneumoniae a M. catarrhalis v biofilmoch zistili, že v prítomnosti S. pneumoniae dochádza k množeniu kultúry M. catarrhalis. Tento fenomén je sprostredkovaný signálnou molekulou Al-2. M. catarrhalis svojou betalaktamázou poskytuje pasívnu ochranu pneumokokom proti betalaktámovým antibiotikám, preto je náročnejšia liečba koinfekcií týchto dvoch mikroorganizmov. S. pneumoniae je baktéria, ktorá v posledných štyridsiatich rokoch sa zaradila medzi terapeuticky problematické mikroorganizmy pre častú multirezistenciu na antibiotiká. Táto nepriaznivá vlastnosť je dôsledkom jej schopnosti rozpoznať, absorbovať a integrovať extracelulárne polydeoxynukleotidy do svojich štrukturálnych génov. Prítomnosť dlhých cudzích DNA sekvencií v génoch pre proteíny viažuce penicilín (PBP), tzv. mozaicizmus, spôsobuje polymorfizmus proteínov PBP, ich zníženú afinitu k penicilínu a zmenenú štruktúru baktérií rezistentných na
peptidoglykán. S. pneumoniae získava cudzie DNA sekvencie podmieňujúce zníženú citlivosť až rezistenciu na penicilín od alfahemolytických streptokokov kolonizujúcich horné dýchacie cesty. Kmene rezistentné na penicilín sú často nositeľmi rezistencie aj na ďalšie skupiny antibiotík, ako sú makrolidy, linkozamidy, tetracyklíny, kotrimoxazol. Pneumokoky získavajú gény rezistencie aj od iných grampozitívnych (napr. stafylokoky, enterokoky) alebo od gramnegatívnych baktérií (napr. E. coli, Klebsiella spp., Neisseria spp., Haemophilus spp.)(9). Cieľom tejto publikácie je monitorovať výskyt kmeňov S. pneumoniae vo výteroch z tonzíl a z nosa u detí do 5 rokov pri akútnych zápaloch horných dýchacích ciest vo vybraných regiónoch Slovenska, zistiť jeho koincidenciu s inými patogénmi alebo potenciálnymi patogénmi horných dýchacích ciest a prezentovať aktuálny stav ich citlivosti na testované antibiotiká podľa kritérií normy EUCAST.

Materiál a metodika

Súbor vzoriek tvorili kmene betahemolytických streptokokov izolovaných z výterov  hrdla  a nosa pri akútnych infekciách horných  dýchacích ciest (diagnózy J00-J06) od  pacientov  v období  od 1. 1. 2014  do 31. 12. 2015  z okresov Komárno a Nové Zámky. Vzorky biologických materiálov odobrali ošetrujúci lekári na detoxikovaný tampón, ktorý po umiestnení do transportného média podľa  Amiesa s aktívnym uhlím bol v deň  odberu transportovaný do laboratória HPL spol. s r. o., v Komárne. Výtery z horných dýchacích ciest boli očkované na  krvný agar  Columbia  so  7 % baranej krvi v súlade so štandardnými postupmi HPL spol. s r. o. Naočkované  kultivačné médiá  boli inkubované 18 až 20 hodín pri teplote 35 °C v prítomnosti 5 % CO2. Po uplynutí lehoty inkubácie  ich hodnotili  laboratórni diagnostici a nálezy  boli zaznamenané v laboratórnom informačnom systéme laboratória. Suspektné kolónie betahemolytických streptokokov boli izolované na kultivačnej  pôde  krvný agar č. 2 so 7 % baranej krvi. Pri identifikácii izolovaných betahemolytických streptokokov sme sa riadili morfológiou ich kolónií a testovali sme ich biochemické vlastnosti. Pri veľkosti kolónií suspektných betahemolytických streptokokov > 0,5 mm sme pokračovali v identifikácii  testom PYR na dôkaz  pyrolidonylarylamidázy, ktorý je z betahemolytických streptokokov pozitívny  len pri S. pyogenes. Pri negatívnom PYR teste sme vykonali VP test (Vogesov-Proskauerov test) na detekciu acetoínu, ktorý býva pozitívny v prípade S. agalactiae, pri betahemolytických streptokokoch skupín C a G je však vždy negatívny. V prípade negatívneho PYR a VP testu pri betahemolytických streptokokoch s veľkosťou kolónií > 0,5 mm sme určili ich skupinovú príslušnosť podľa Lancefieldovej metódou latexovej aglutinácie.  Suspektné kolónie  S.  agalactiae sme overili CAMP testom. V prípade betahemolytických streptokokov s veľkosťou  kolónií < 0,5 mm  sme vykonali VP test a v prípade pozitivity sme ich zaradili do Streptococcus anginosus group. Sledovali  sme výskyt  prípadných atypických reakcií,  vtedy sme vždy overili suspektné kolónie betahemolytických streptokokov mikroskopickým preparátom farbeným podľa  Grama a zároveň sme vizuálne  skontrolovali čistotu izolovanej bakteriálnej kultúry. Citlivosť kmeňov  na antibiotiká sme testovali diskovou difúznou  metódou podľa zásad EUCAST na kultivačnom médiu MHF – agar podľa Muellera a Hintonovej so 7 % konskej krvi a NAD. Testovali sme citlivosť kmeňov na penicilín (PEN), erytromycín (ERY), klindamycín  (CLI), ofloxacín (OFL), tetracyklín (TET). Inhibičné  zóny  antibiotík PEN, ERY, CLI a TET sme hodnotili podľa zásad normy EUCAST(12), inhibičnú  zónu  OFL sme hodnotili podľa americkej normy CLSI(14). Spolu  s testom citlivosti  sme hodnotili  aj diagnostický disk s obsahom 0,04 jednotiek bacitracínu, ktorý bol umiestnený na  pôdu  MHF spolu s diskami na  antibiotickú citlivosť. Bacitracínový disk slúži ako skríningový test na dôkaz S. pyogenes, ktorý nerastie v okolí disku s bacitracínom (0,04 j.) Ostatné streptokoky bacitracín v nízkej koncentrácii tolerujú.  Ak je priemer  inhibičnej zóny okolo disku  s 0,04 j. bacitracínu ≥ 10 mm, môže  ísť o S. pyogenes, ak je priemer inhibičnej zóny ≤ 10 mm, je pravdepodobné, že ide o betahemolytický streptokok inej sérologickej skupiny.

Výsledky

Za obdobie od 1. 1. 2014 do 31. 12. 2015 v laboratóriu HPL spol.  s r. o., v Komárne  sme vyšetrili celkovo  68 138 vzoriek z horných  dýchacích ciest  od pacientov s diagnózami akútneho zápalu horných  dýchacích ciest, z toho  47 548  výterov hrdla a 20 588 výterov nosa. Izolovali sme 3 900 (5,72 %) kmeňov betahemolytických  streptokokov: 3  729  (5,47  %) z  výterov hrdla a 171 (0,25 %) z výterov nosa. Sledovali sme výskyt S. pyogenes, S. agalactiae, betahemolytických streptokokov ostatných skupín a masívne nálezy podmienene patogénneho streptokoka S. anginosus group vo vzorkách z horných dýchacích ciest  pacientov (tabuľka 1).

Rozloženie nálezov betahemolytických streptokokov v našom súbore znázorňuje graf 1.

Vo výskyte  betahemolytických streptokokov sme zaznamenali výraznú  sezonalitu. Streptokokové nákazy horných dýchacích ciest boli  najčastejšie v jesenných a  zimných mesiacoch, v jarných  mesiacoch ich výskyt poklesol a v lete dosahoval najnižšie hodnoty. Výskyt betahemolytických streptokokov v jednotlivých mesiacoch uvádzame v tabuľke 2. Sezonálny výskyt jednotlivých druhov betahemolytických streptokokov je znázornený na grafe 2 pyogenes (HSA) sa vyskytoval najčastejšie v období od októbra do decembra s vrcholom výskytu v novembri. Výskyt betahemolytických streptokokov sk. C a G kulminoval v jesenných mesiacoch, najmä  v septembri a novembri. S. agalactiae  sa vyskytoval  prevažne v jarných, kým S. anginosus group v zimných mesiacoch.

Sledovali  sme výskyt betahemolytických streptokokov aj v jednotlivých  vekových  kategóriách. Zistili sme najväčšiu vnímavosť na  infekciu  S. pyogenes u detí  vo veku od 7 do 11 rokov, t. j. v mladšom školskom veku. Výskyt jednotlivých druhov betahemolytických streptokokov podľa vekových kategórií znázorňuje tabuľka 3.

Percentuálne zastúpenie  rezistentných kmeňov na  testované antimikrobiálne látky klindamycín  (CLI), erytromycín (ERY), ofloxacín (OFL), penicilín (PEN), tetracyklín (TET) znázorňuje  tabuľka 4.

Diskusia

Betahemolytické  streptokoky sú významnými pôvodcami bakteriálnych infekcií horných dýchacích ciest, z nich najvýznamnejší je Streptococcus pyogenes, primárny patogén, pôvodca bakteriálnej tonzilofaryngitídy. V literatúre sa uvádza, že S. pyogenes býva etiologickým faktorom tohto ochorenia v 5 až 17 % prípadov infekcie u dospelých(6) a v 20 až 30 % prípadov  tonzilofaryngitídy u detí(7). Tieto výsledky vyplývajú z cielených štúdií založených na dôkladnom výbere pacientov na základe klinických príznakov. Keďže klinická symptomatológia  streptokokovej tonzilofaryngitídy nie je vždy typická, do našej štúdie sme zaradili všetkých pacientov, ktorí mali diagnózu akútneho zápalu v oblasti horných dýchacích ciest. V našom súbore sme zistili streptokokovú etiológiu u 5,72 % pacientov prejavujúcich príznaky  akútneho zápalu horných dýchacích ciest  s najvyšším podielom S. pyogenes (2,22 %). Bližšou  analýzou výsledkov  sme zistili, že táto baktéria sa podieľa  na  38,69  % všetkých tonzilofaryngitíd vyvolaných betahemolytickými streptokokmi a najčastejšie sa vyskytuje u detí vo vekovej skupine 7 až 11 rokov, kde spôsobuje až 16,51 % faryngitíd streptokokovej etiológie.

Betahemolytické streptokoky iných skupín  ako A, prevažne B, C a G môžu  spôsobovať klinický obraz podobný ako pri tonzilofaryngitíde vyvolanej S. pyogenes. Tiemstra a kol. (8) vykonali retrospektívnu analýzu  priebehu ochorenia 915 pacientov, ktorí navštívili praktického lekára pre bolesti hrdla s klinickými príznakmi streptokokovej  faryngitídy.  Hľadali zhodu  alebo  odlišnosti klinických príznakov  v závislosti od druhu  izolovaného  betahemolytického  streptokoka. Z 915 pacientov 63  % malo  negatívny bakteriologický kultivačný nález,  prítomnosť  S. pyogenes potvrdili  u 16  % pacientov, betahemolytický streptokok sk.  C bol izolovaný  u 9 %, sk. B u 6 %, sk. G u 4 %, sk. F u 1 % a netypovateľné betahemolytické streptokoky u 1 % pacientov. Zistili, že bolesť hlavy, zvýšená teplota, faryngálny  exudát a krčná lymfadenopatia sú príznaky  typické  pri streptokokovej faryngitíde bez  ohľadu na druh  vyvolávateľa.

Vekový priemer pacientov bol 26 rokov. V našom súbore dospelých pacientov sa tiež  potvrdilo najvyššie percentuálne zastúpenie S. pyogenes pri faryngitídach streptokokovej etiológie (8,51 %). Betahemolytické streptokoky sk. B a C (4,95 %, 4,44 %) boli zastúpené približne v rovnakom pomere a sk. G bola dokázaná v nízkom percente (1,85 %). Faryngitídy spôsobené inými betahemolytickými streptokokmi ako  S. pyogenes je odporúčané preliečiť antibiotikami v záujme skoršieho uzdravenia a pre zníženie rizika šírenia infekcie na ľudí v blízkosti pacienta. Osobitne dôležité je zamedziť šírenie  infekcie  v prítomnosti imunosuprimova- ných ľudí, tehotných žien a novorodencov v domácnosti chorého(8). V prípade betahemolytických streptokokov skupiny C existuje určité, síce  veľmi nízke, riziko vzniku postinfekčnej glomerulonefritídy. V literatúre sa opisuje najmä  v súvislosti s nálezom betahemolytického streptokoka skupiny C zvieracieho pôvodu Streptococcus equi subspecies zooepidemicus nielen po systémovej infekcii(9), ale aj v súvislosti s nálezom vo výteroch  z hrdla pacientov(10). S. anginosus group je skupina betahemolytických streptokokov, ktorých  niektorí  príslušníci majú potenciál spôsobovať faryngitídu  alebo  stav spojený s bolesťami hrdla. V poslednom období  využitím moderných metód molekulárnej biológie je snaha zrevidovať taxonómiu S. anginosus group s osobitným dôrazom na odlíšenie betahemolytických kmeňov patriacich do Lancefieldovej skupiny C, medzi  ktorými sú  pôvodcovia faryngitíd(11). Keďže v podmienkach rutinných laboratórií nie je možnosť presnej druhovej identifikácie izolovaných kmeňov  S. anginosus group a stanovenie skupinovej príslušnosti je problematické z dôvodu slabého nárastu izolovaných kmeňov, do štúdie sme zaradili všetky masívne nálezy tejto skupiny betahemolytických streptokokov pri zápalových diagnózach horných  dýchacích ciest. Najviac takýchto nálezov sme zaznamenali v skupine dospelých pacientov, kde tvorili 20,92 % betahemolytických streptokokov izolovaných od pacientov tejto vekovej skupiny.

Vo výskyte  streptokokových infekcií  horných  dýchacích ciest sme zaznamenali sezonalitu s najčastejším výskytom v jesenných a zimných mesiacoch, s poklesom v jarných mesiacoch a s najnižším výskytom  počas leta.

Betahemolytické streptokoky sú  stále stopercentne citlivé na penicilín, v ambulantnej liečbe  je perorálny fenoxymetylpenicilín liekom voľby. Výnimkou je S. agalactiae,  v prípade ktorého európska norma na testovanie citlivosti EUCAST neobsahuje interpretačné kritériá fenoxymetylpenicilínu, použitie tohto antibiotika v liečbe infekcií spôsobených S. agalactiae  preto  nie je odporúčané(12). Vhodnejšie sú  iné penicilínové  antibiotiká alebo  cefalosporíny 1. a  2. generácie. U pacientov alergických na penicilín v liečbe streptokokových infekcií sú  alternatívnou voľbou makrolidové alebo  linkozamidové antibiotiká, prípadne cefalosporíny 1. a 2. generácie. Nárast rezistencie na makrolidy v rámci Slovenskej republiky je pozorovaný od roku 2001, vtedy bola zaznamenaná rezistencia v 19 % kmeňov S. pyogenes. V roku 2010 priemerná rezistencia kmeňov S. pyogenes na makrolidy bola 32,5 %, v rokoch 2012 – 2013 sa pohybovala v rozmedzí 29 – 30 % (13). V našom súbore sme zaznamenali 16 % rezistenciu S. pyogenes na makrolidové antibiotiká. V prípade S. agalactiae  sme zaznamenali 36 % rezistenciu na makrolidy, pri betahemolytických streptokokoch sk. C bolo 25 % kmeňov rezistentných na makrolidové antibiotiká a pri betahemolytických streptokokoch skupiny G bola rezistencia až 41 %. V prípade linkozamidov bola miera  rezistencie podobná ako pri makrolidoch. Pozoruhodná bola rezistencia S. agalactiae  na tetracyklínové antibiotiká, ktorá dosahovala 69 %. Testované kmene boli citlivé na zástupcu fluorovaných chinolónov ofloxacín, ktorého citlivosť sme interpretovali podľa zásad americkej normy CLSI(14).

Záver

V našom súbore bol S. pyogenes dominantným pôvodcom bakteriálnej tonzilofaryngitídy u detí  v mladšom školskom veku. Liekom voľby týchto  infekcií ostáva naďalej fenoxymetylpenicilín. Rezistencia na makrolidové a linkozamidové  antibiotiká bola  v našom súbore najnižšia pri kmeňoch S. pyogenes. Zriedkavejší bol výskyt betahemolytických streptokokov sk. C a G, pri ktorých  je takisto stopercentná citlivosť  na  penicilín,  zaznamenali sme však  výrazne  vyššiu rezistenciu na makrolidové a linkozamidové antibiotiká. V prípade S. agalactiae sa liečba fenoxymetylpenicilínom neodporúča, liekom voľby sú iné penicilínové antibiotiká alebo cefalosporíny. Vzhľadom  na tieto  zistenia je na mieste zdôrazniť dôležitosť mikrobiologickej kultivačnej  analýzy  s určením  druhu a/alebo skupinovej  príslušnosti betahemolytického streptokoka a citlivosti na antibiotiká, aby v prípade potreby pacienti dostávali indikovanú  a cielenú liečbu bakteriálnej tonzilofaryngitídy.

Literatúra
1. Syrjanen RK, et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Finnish children younger than 2 years old. The Journal of Infectious Diseases 2001; 184: 451-459.
2. Bogaert D, de Groot R, Hermans PWM Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. The Lancet Infectious Diseases 2004; 4: 144-154.
3. McCullers JA, Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus. Clinical Microbiology Reviews 2006; 19: 571-582.
4. Astrid A, et al. Viral and Bacterial Interactions in the Upper Respiratory Tract. Plos Pathogens 2013; 9(1): e1003057.
5. Regev-Yochay G, et al. Is nasopharyngeal carriage of Streotococcus pneumoniae protective against carriage of Staphylococcus aureus? 43rd ICCAC; Chicago; sept 14-17, 2003, abstr. G-2048.
6. Pericone CD, et al. Inhibitory and bactericidal effects of hydrogen peroxide production by Streptococcus pneumoniae on other inhabitants of the upper respiratory tract. Infection and Imunity 2000; 68(7): 3990-3997.
7. Shakhnovich EA, King SJ, Weiser JN Neuraminidase expressed by streptococcus pneumoniae desialylates the lipopolysaccharide of Neisseria meningitidis and Haemophilus influenzae: A paradigm for interbacterial
competition among pathogens of the human respiratory tract. Infection and Imunity 2002; 70(12): 7161-7164.
8. Perez AC, Pang B, King LB, et al. Residence of Streptococcus pneumoniae and Moraxella catarrhalis within polymicrobial biofilm promotes antibiotic resistance and bacterial persistence in vivo. Pathogens and disease
2014; 70(3): 280-288.
9. Tomasz A. Antibiotic resistence in Streptococcus pneumoniae. Clinical Infectious Diseases 1997; 24(Suppl 1): S85-8.
10. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters Version 4.0, valid from 2014-01-01, Dostupné na http://www.eucast.org/
11. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters Version 5.0, valid from 2015-01-01, Dostupné na http://www.eucast.org/
12. Stacevičiene I, et al. Antibiotic resistance of Streptococcus pneumoniae, isolated from nasopharynx of preschol children with acute respiratory tract infection in Lithuana. BMC Infectious Diseases 2016; 16: 216.
13. Ferreira LM, et al. Nasopharyngeal colonisation and antimicrobial resistance of Streptococcus pneumoniae isolated from children with acute rhinopharyngitis. Journal de Pediatria 2001; 77(3): 227-234.
14. Kumar KLR, et al. Nasopharyngeal carriage, antibiogram & serotype distribution of Streptococcus pneumoniae among healthy under five children. Indian J Med Res 2014; 140: 216-220.
15. Luminos M, et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Romanian children before the introduction of the pneumococcal conjugated vaccination into the national immunization programe: a national, multicentre, cross-sectional observational study. International
Journal of Infectious Diseases 2014; 29: 169-173.
16. Mayanskiy N, et al. Serotypes and antibiotic resistance of non-invasive Streptococcus pneumoniae circulating in pediatric hospitals in Moscow, Russia. International Journal of Infectious Diseases 2014; 20: 58-62.
17. Líšková A. Racionálna antibiotická terapia respiračných infekcií. Primárny kontakt 2014; 2(6): 14-16.
18. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, twenty fourth informational supplement, CLSI 2014; M100-S24
19. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing , twenty fourth informational supplement, CLSI 2015; M100-S25
20. Liofilchem® – MIC Test Strip Technical Sheet Streptococcus pneumoniae – MTS23 Rev.6