*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper. 

Úvod

Každý rok sa preeklampsia (PE) rozvinie u 10 miliónov žien na celom svete, pričom niektoré z nich zomrú na PE a s ňou súvisiace hypertenzné ochorenia. Počet detí, ktoré zomrú na tieto komplikácie, je tiež veľmi vysoký. PE pred­stavuje jednu z najzávažnejších komplikácií počas tehoten­stva, ktorá postihuje 2 – 8 % všetkých tehotných žien a je zodpovedná takmer za 40 % predčasných pôrodov pred 35. týždňom tehotenstva⁽¹⁾. PE je klinicky definovaná ako nový nástup hypertenzie počas druhej polovice tehotenstva. Pred­pokladá sa, že PE sa začína asymptomatickou fázou počas prvého trimestra gravidity, keď už dochádza k nedostatočnej invázii trofoblastu a k neúplnej remodelácii špirálových artérií. Oba tieto procesy prispievajú k zvýšeniu oxidačného stre­su a vzniku systémovej endotelovej dysfunkcie, ktorá vedie k charakteristickým prejavom PE v neskorších fázach ochorenia⁽²⁾. V súčasnosti neexistuje účinná liečba, ktorá by zabrá­nila dlhodobým následkom PE, pretože samotná patofyzioló- gia ochorenia nie je úplne objasnená.

Exozómy a tehotenstvo

Exozómy sú malé bioaktívne vezikuly, tvorené rôznymi typ­mi buniek, z ktorých sú sekretované do okolitých telových tekutín. Produkujú ich najmä T-bunky, B-bunky, dendritické bunky, kmeňové bunky, neuróny, epitelové bunky, krvné bun­ky, tumorové či placentárne bunky. Vyskytujú sa najmä v krv­nej plazme, moči, plodovej vode, cerebrospinálnej tekutine či v materskom mlieku. Veľkosť exozómov sa pohybuje od 40 do 100 nm. Ich obsah je veľmi variabilný a širokospektrálny. Obsahujú dôležité proteíny z mnohých proteínových rodín, ktoré sa zúčastňujú na viacerých bunkových proce­soch. Prítomné sú tiež lipidy. Dôležitou súčasťou exozómov sú aj nukleové kyseliny, najmä mikroRNA (miRNA) a mRNA⁽³⁾ (obrázok 1).

Počas tehotenstva sa matkin organizmus prispôsobuje mnohým zmenám a procesom. Túto úlohu plní najmä pla­centa, ktorá sa tiež podieľa na regulácii rastu a vývoja plo­du. Nedávne štúdie potvrdili, že počas tehotenstva placentárne bunky, konkrétne cytotrofoblasty a syncýciotrofoblasty  už od 6. týždňa uvoľňujú exozómy, ktoré sa následne dostá­vajú do matkinej cirkulácie⁽⁴⁾. Placentou produkované exozó­my majú rovnaký tvar a veľkosť ako ostatné exozómy, avšak obsahujú špecifické proteíny a miRNA, na základe ktorých ich vieme odlíšiť. Exprimujú typické markery CD63 a PLAP, tiež proapoptotické molekuly FasL a TRAIL⁽⁵⁾. V porovnaní s inými exozómami majú absenciu expresie MHC molekúl, namiesto nich na svojom povrchu exprimujú molekuly MICA/B a RAET1/ULBP1-5 podobné MHC. Je preukázané, že koncentrácia exozómov v periférnej krvi matky je vyš­šia ako u netehotnej ženy a možno ich kvantifikovať pomo­cou markera PLAP. Počas fyziologického tehotenstva sa tá­to koncentrácia v plazme matky zvyšuje, ale v závislosti od štádia tehotenstva sa môže meniť⁽⁶⁾. Placentou produkované exozómy môžu v období tehotenstva ovplyvňovať aj imunit­ný systém matky. Vďaka svojim špecifickým proteínom mô­žu znížiť proliferáciu a aktiváciu T-buniek, supresiu cytokínovej signalizácie, možnú indukciu apoptózy, a tak prispievať k celkovej ochrane plodu. Na druhej strane však nadmer­né potlačenie imunitného systému matky môže zvýšiť rizi­ko infekcií v priebehu tehotenstva. Počas tehotenstva nepro­dukuje exozómy iba placenta, ale aj samotné embryo či iné materské tkanivá⁽⁵⁾.

Celkový počet exozómov prítomných v materskej plazme je približne 2-násobne vyšší u žien medzi 11. až 14. týždňom tehotenstva, u ktorým bol medzi 22. – 28. týždňom diagnos­tikovaný gestačný diabetes mellitus, v porovnaní so ženami s normoglykemickým tehotenstvom. Tieto údaje naznačujú, že zmeny v koncentrácii exozómov prítomné v materskom krvnom obehu v počiatočných štádiách tehotenstva prispie­vajú k rozvoju tehotenských komplikácii (diabetes a PE) ne­skôr počas tehotenstva⁽⁷⁾.

Predchádzajúce in vitro štúdie ukázali, že hypoxia indu­kuje uvoľňovanie exozómov z trofoblastických buniek, kto­ré ovplyvňujú obsah aj interakciu s inými bunkami. PE je spojená s placentárnou hypoxiou, ktorá vedie k nedostatoč­nej remodelácii špirálovej artérie počas prvých 20 týždňov tehotenstva®. Tieto pozorovania podporujú domnelú užitoč­nosť placentárnych exozómov ako biomarker v ranom teho­tenstve s rizikom vzniku PE u žien. Avšak doteraz je málo in­formácií o exozómovom profile počas PE tehotenstiev.

mikroRNA

V súčasnosti sa pozornosť sústreďuje čoraz viac na mo­lekuly miRNA. miRNA je malá, približne 18 až 24 nukleotidov dlhá nekódujúca sekvencia, ktorej najdôležitejšou vlastnos­ťou je podieľanie na regulácii génovej expresie. Tú ovplyvňuje na základe svojej komplementarity s mRNA na 3′ konci. Ľud­ský genóm kóduje viac ako 1 000 druhov miRNA a zdá sa, že môžu ovplyvňovať až 60 % génov. Väčšina miRNA mole­kúl je lokalizovaných v bunkách, no niektoré miRNA, známe aj ako cirkulujúce, sa nachádzajú v extracelulárnom priesto­re, napríklad v telových tekutinách. Nezvyčajná expresia miR­NA je pozorovaná pri rôznych patológiách a pri zmenách fy­ziologického stavu⁽⁹⁾.

Extracelulárne miRNA (ECmiRNA) sú v súčasnosti pova­žované za vhodné biomarkery rôznych ochorení, keďže ich expresný profil z extracelulárnych telových tekutín zobrazu­je patofyziologický stav organizmu. Na izoláciu ECmiRNA je potrebné zvoliť vhodnú telovú tekutinu. Periférna krv sa neu­kazuje ako vhodný zdroj, pretože bunkové pozostatky z bie­lych a červených krviniek tiež obsahujú miRNA, ktorá môže ovplyvniť ECmiRNA analýzu. Výhodnejšie sa preto zdá pou­žitie plazmy⁽¹⁰⁾.

Vďaka svojmu unikátnemu zloženiu sú exozómy vhod­né aj na rôzne diagnostické účely. Na diagnostiku mnohých ochorení sa využívajú najmä ich proteíny a miRNA. Zmena koncentrácie exozomálnych proteínov je asociovaná s pato­lógiami alebo aj s ich progresiou či odpoveďou na oxidač­ný stres⁽⁴⁾.

miRNA a tehotenstvo

Expresia miRNA nie je zmenená len v priebehu ochore­ní, ale aj počas tehotenstva. Vtedy sú miRNA produkované najmä trofoblastickými bunkami placenty a predpokladá sa, že majú vplyv na angiogenézu, diferenciáciu trofoblastu a re­guláciu imunitného systému matky i plodu. V priebehu te­hotenstva môžu byť takisto využité ako biomarkery, pretože pozmenená expresia miRNA môže byť predzvesťou kompli­kácií. Či už je tehotenstvo komplikované, alebo nie, placentárne miRNA sú primárne lokalizované v štyroch polycistronických klastroch. Klastre C19MC a miR-371-3 sa nachádzajú na chromozóme 19, miR-17-92 na chromozóme 13 a M14MC na chromozóme 14. Počas tretieho trimestra placenta okrem týchto klastrov exprimuje let-7 rodinu, miR-34 rodinu, miR-29 klaster, miR-195 klaster a miR-181c. miRNA produkované chromozómom 21, miR-99a, miR-125 b-2 a miR-155, môžu byť nadexprimované u tehotných žien v porovnaní s netehot- nými⁽¹¹⁾.

Najväčší známy ľudský miRNA klaster je C19MC a skladá sa z 54 miR génov. Okrem placenty je exprimovaný nedife­rencovanými bunkami a uvoľňuje miRNA do matkinho obe­hu pomocou exozómov tvorených placentou. Zvyšné klastre obsahujú podstatne menej génov⁽¹²⁾.

Expresia miR génov neostáva počas celého tehotenstva rovnaká, miR z klastra C19MC sa zvyšujú od prvého trimestra až po tretí. Gény z klastra C14MC sú upregulované v prvom trimestri a v treťom už klesajú. Oproti prvému trimestru je v treťom trimestri tiež upregulovaný let-7 a miR-34 rodiny a miR-29a, miR-195 a miR-181c. Tieto rodiny väčšinou zo­hrávajú úlohu v diferenciácii, proliferácii či apoptóze buniek. Počas gestačného obdobia miRNA produkované placentou zohrávajú dôležitú úlohu aj v imunitnom systéme, na úrovni vrodenej aj získanej imunitnej odpovede. Na rozdiel od iných miRNA sú exprimované počas celého tehotenstva⁽¹³⁾.

Preeklampsia v súvislosti s exozómami a miRNA

Ako regulačné molekuly môžu miRNA svojou dysreguláciou významne ovplyvňovať procesy spájané s vývinom pla­centy a s celým tehotenstvom. Mnoho štúdií preukázalo, že zmenená úroveň expresie miRNA v placente je spájaná s preeklampsiou⁽¹⁴⁾. Pozorovanými dysreguláciami sú napríklad DNA metylácia a modifikácia histónov, a teda pravdepodob­ne nie je náhoda, že práve miRNA má schopnosť regulovať gény týmto spôsobom. Najčastejšími zmenenými miRNA pri preeklampsii sú miR-210, miR-223 a miR-126, ktoré úzko sú­visia s patogenézou preeklampsie⁽¹⁵⁾.

Dôležitú úlohu zohráva miRNA v procese angiogenézy, ktorá je rozhodujúca pri remodelácii špirálovitých artérií. Podľa mnohých štúdií viacero upregulovaných miRNA v preeklamptickej placente, napr. miR-210, miR-20 b, bráni angiogenéze a/alebo proliferácii trofoblastu, invázii a migrácii. Avšak niektoré down-regulované (miR-378a-5p, miR-376c), naopak, podporujú proliferáciu trofoblastu aj inváziu⁽¹⁶⁾. Po­čas angiogenézy sú nenahraditeľné angiogénne faktory, ktorých bohatým zdrojom je najmä placenta, endometrium a deciduum. Proces angiogenézy je iniciovaný rastovými fak­tormi FGF, VEGF či PlGF. Gény týchto faktorov sú však cie­ľom pre rôzne miRNA. Nasvedčuje to tomu, že miRNA majú kritickú úlohu pri tvorbe angiogénnych faktorov počas preklinického štádia preeklampsie. Zistilo sa, že miR-16, miR- 26 b, miR-29 b, miR-181a, miR-195, miR-222 a miR-335 sú nielen zvýšené v preeklamptickej placente, ale ich cieľom sú práve VEGF-A a PlGF. Okrem toho niektoré z nich ovplyvňo­vali CYR61, ktorý je dôležitý pre vaskulárnu integritu⁽¹⁷⁾. Ďal­šia štúdia poukazuje na miR-126, ktorej cieľom je negatívny regulátor faktora VEGF. Táto miRNA by preto mohla byť v bu­dúcnosti zvolená ako možný terapeutický cieľ. Okrem týchto faktorov však miRNA pozitívne aj negatívne vplývajú na ďal­šie faktory spájané s placentárnou angiogenézou. So vzni­kom hypoxie zrejme súvisí aj miR-210, ktorej zvýšená úro­veň expresie je spájaná s hypoxiou citlivými faktormi HIF-1a a NF-kB. Na základe bioinformatickej analýzy sa predpokla­dá, že miRNA z rodiny miR-17, miR-20 a miR-20 b tiež súvi­sia s angiogenézou svojím vplyvom na HIF-1a, interleukín-8, EFNB2, EPHB4 a VEGF⁽¹⁸⁾. Bunky syncýciotrofoblastu produ­kujú špecifické placentárne typy miRNA, ktoré sa z buniek placenty vbaľujú do exozómov a následne prechádzajú do te­lových tekutín. Priamo z placenty sa teda miRNA môže izo­lovať, ale jedine pri pôrode, pretože počas tehotenstva je to bez ohrozenia plodu a matky nemožné. Preto sa izolácia placentárnych exozómov z maternálnej plazmy javí ako vhodný neinvazívny prístup na získanie placentárnych miRNA s cie­ľom prenatálnej diagnostiky⁽¹⁹⁾.

miRNA sekvenovanie

Vďaka rýchlemu pokroku pri technológiách sekvenovania novej generácie vieme sekvenovať aj molekuly RNA s cie­ľom zistiť expresný profil. Najčastejšie ide o mRNA a miRNA. Vďaka vysokoparalelnému sekvenovaniu môže byt’ analyzo­vaná celá ľudská miRNA populácia, ktorá môže byť analy­zovaná aj pomocou qRT-PCR či RNA mikročipu⁽²⁰⁾. qRT-PCR a Microarray sú relatívne lacné a zaužívané analytické me­tódy, no ich nevýhodou je, že vedia analyzovať jedine známe sekvencie. Pomocou sekvenčnej analýzy možno objaviť aj nové, doposiaľ neidentifikované typy miRNA.

Záver

Vývoj technológie sekvenovania miRNA poskytol nové možnosti aj pre prenatálnu diagnostiku. V súčasnosti sa vieme zamerať na špecifické placentárne miRNA pri riziko­vých tehotenstvách. Dôležitá je napríklad diagnostika preeklampsie, ktorá často ohrozuje život matky aj plodu. Zmena expresného profilu týchto molekúl môže nielen zabezpe­čiť včasnú diagnostiku, ale aj pomôcť objasniť príčiny tohto ochorenia či nájdenie vhodnej terapie.

LITERATÚRA

1. Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia. Seminars in Perinatology 2009; 33: 130-137.
2. Maynard SE, Karumanchi SA. Angiogenic factors and preeclampsia. Seminars in Nephrology 2011; 31: 33-46.
3. Qin J, Xu Q. Functions and applications of exosomes. Acta Poloniae Pharmaceutica 2014; 71: 537-543.
4. Salomon C, Ryan J, Sobrevia L, et al. Exosomal Signaling during Hy­poxia Mediates Microvascular Endothelial Cell Migration and Vasculogen- esis. PLoS One 2013; 8: e68451.
5. Mincheva-Nilsson L, Baranov V. The role of placental exosomes in re­production. Am J Reprod Immunol 2010; 63: 520-533.
6. Sarker S, Scholz- Romero K, Perez A, et al. Placenta-derived exosomes continuously increase in maternal circulation over the first trimester of pregnancy. J Transl Med 2014; 12: 204.
7. Murray MD, Hassendrini PN, Miharu K, et al. Placental Exosomes in Normal and Complicated Pregnancy. Am J Obstet Gynecol 2015; 213: 173-181.
8. Rice GE, Scholz-Romero K, Sweeney E, et al. The Effect of Glucose on the Release and Bioactivity of Exosomes From First Trimester Trofoblast Cells. J Clin Endocrionol Metab 2015; 100: 1280-1288.
9. Sohel MH. Extracellular/Circulating MicroRNAs: Release Mecha­nisms, Functionsvand Challenges. Achievements in the Life Sciences 2016; 10: 175-186.
10. Pritchard CC, Kroh E, Wood B, et al. Blood cell origin of circulating mi­cro RNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prec Res 2012; 5: 492-497.
11. Kotlabova K, Doucha J, Chudoba D, et al. Extracellular chromosome 21-derived microRNAs in euploid & aneuploid Indian J Med Res 2013; 138: 935-943.
12. Noguer-Dance M, Abu-Amero S, Al-Khtib M, et al. The primate-specif­ic microRNA gene cluster (C19MC) is imprinted in the placenta. Hum Mol Genet 2010; 19: 3566-3582.
13. Gu Y, Sun J, Groome LJ, et al. Differential miRNA expression profiles between the first and third trimester human placentas. Am J Physiol En­docrinol Metab 2013; 304: E836-843.
14. Gunel T, Hosseini MK, Gumusoglu E, et al. Future Perspective of Preeclampsia by miRNA. Global J. Hum. Genet. Gene Ther 2014; 2: 68-78.
15. Soleymanlou N, Jurisica I, Nevo O. Molecular evidence of placental hypoxia in preeclampsia. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90: 4299-4308.
16. Gunel T, Hosseini MK, Gumusoglu E, et al. Future Perspective of Preeclampsia by miRNA. Global J. Hum. Genet. Gene Ther 2014; 2: 68-78.
17. Hu Y, Li P, Hao S, et al. Differential expression of microRNAs in the placentae of Chinese patients with severe pre-eclampsia. Clin Chem Lab Med 2009; 47: 923-929.
18. Chen DB, Wang W. Human placental microRNAs and preeclampsia. Biol Reprod 2013; 88: 130.
19. Sheikh AM, Small HY, Currie G, et al. Systematic Review of Micro-RNA Expression in Pre-Eclampsia Identifies a Number of Common Pathways Associated with the Disease. PLoS One 2016; 11: e0160808.
20. Wang J, Raimondo M, Guha S, et al. Circulating microRNAs in pancre­atic juice as candidate biomarkers of pancreatic cancer. J Cancer 2005; 5: 696-705.