*A rare case of autochthonous human dirofilariasis with the manifestation of pseudotumor of the epididymis caused by helminth Dirofilaria repens
Úvod
Súčasťou manažmentu pacienta s urolitiázou je evaluácia extrahovaných alebo spontánne vylúčených močových konkrementov. Toto hodnotenie má byť dostatočne presné na to, aby sa dokázala prítomnosť majoritných zložiek konkrementu. Konkrementy môžu byť analyzované z hľadiska chemického zloženia, tvaru kryštálov, farby, tvrdosti a morfológie(1).
Vlastnosti konkrementov úzko súvisia s prevládajúcim rizikovým faktorom, preto je pre liečbu pacientov s urolitiázou potrebné vykonať analýzu správne. Konkrementy môžu byť chemicky aj morfologicky homogénne alebo pozostávajú z viacerých frakcií. Homogénne konkrementy sú výsledkom jednoduchších procesov odohrávajúcich sa v prostredí s konštantnými vlastnosťami. Viaczložkové konkrementy vznikajú v prostredí s variabilnejšími vlastnosťami. Výsledný charakter konkrementu je závislý od charakteru prostredia, v ktorom konkrement vzniká, a od jeho variability v čase. Evaluácia jednotlivých frakcií viaczložkových konkrementov môže odhaliť problém (metabolickú zmenu), ktorý bol vyšetrením krvi alebo moču nezistený. Presnou analýzou konkrementu dokážeme lepšie určiť rizikové faktory vzniku urolitiázy. Vo vzťahu k rizikovým faktorom dokážeme určiť rizikové potraviny a následne upraviť stravovacie návyky tak, aby nedochádzalo k recidívam(1,2).
Prevažné množstvo laboratórií na Slovensku aj vo svete používa zastaranú chemickú titračnú analýzu. Pri vysokej miere nepresností a chýb dochádza často k nesprávnemu určeniu chemického zloženia konkrementu (viac ako 50 % konkrementov je určených chybne)(2).
Materiál a metodika
Všetky vzorky majú humánny pôvod. Nie sú známe bližšie údaje o pacientoch.
Morfologické štúdie. Konkrementy boli pozorované bino-kulárnou lupou Nikon SZM 1500 s SD-Fi2 kamerou s maximálnym zväčšením 11,25x z vonkajšej, po sekcii konkrementu z vnútornej strany pri odrazenom svetle.
Infračervená spektroskopia (FTIR). Vzorky boli homogenizované na prášok. Výsledkom merania je spektrum s charakteristickými molekulovými vibráciami, ktoré sa prejavujú ako absorpčné pásy. Spektrálny záznam bol vyhotovený prístrojom Nicolet iS50 v rozmedzí 4 000 – 400 cm–1 použitím tech-niky zoslabeného úplného odrazu (ATR) na diamantovom kryštále. Záznam pozostáva zo 64 skenov v 2 cm–1 krokoch.
Ramanova spektroskopia (RAMAN). Analýzy boli vykonané bez dodatočnej úpravy vzorky spektrometrom LabRAM-HR 800 – verzia UV-VIS-NIR vybaveného mikroskopom Olympus BX-41 s maximálnym zväčšením 100x. Mikroskop pozostáva z CCD detektora Synapse chladeného Peltierovým článkom (–70 °C) s difrakčnou mriežkou 600 vrypov/mm. Na meranie boli použité lasery s vlnovou dĺžkou 532 nm (Nd: YAG) a 633 nm (He-Ne). Celková dĺžka záznamu dosahovala 8 – 120 minút.
Prášková difrakčná analýza (PXRD). Práškové preparáty boli vložené do prístrojovej komory tak, aby sa zabránilo horizontálnemu usporiadaniu kryštálov a analyzované rtg. difraktometrom Bruker D8 Advance SolXE. Žiarenie s napätím 40 kV a prúdom 40 mA z W vlákna dopadalo na Cu anódu s λ = 1,540562 Å. Boli zaznamenané skeny v krokoch 0,02°/0,8 s v rozmedzí 2 – 65°. Výsledkom merania je difrakčná tabuľka, ktorá udáva hodnoty medzirovinných vzdialeností a intenzít vo vzťahu k Millerovým indexom. Priemerné referenčné hodnoty boli vypočítané z doposiaľ publikovaných hodnôt.
Elektrónová mikroskopia (SEM) a mikroanalýza (EDS). Na vzorky bola nanesená vrstva uhlíka, v prípade EDS boli vzorky narezané. Analýza bola vykonaná mikroskopom JEOL JSM-6390LV. Prostredníctvom mikroanalyzátora JEOL JXA 8530 F so spektrometrom SDD a rozlíšením 133 eV sa vykonala distribúcia prvkov v konkrementoch.
Výsledky
Morfologické štúdie
Pozorovanie vzoriek pod binokulárom (obrázok 1 A, B) odhalilo rozdiely v morfologických vlastnostiach konkrementov. Pozorujeme odlišné sfarbenie, vnútornú aj povrchovú štruktúru. Pri konkrementoc sú prítomné koncentrické vrstvy. Na určenie chemického zloženia bola vykonaná analýza FTIR.
Infračervená spektroskopia (FTIR) a Ramanova spektroskopia (RAMAN)
Metódou FTIR bol vo vzorke na obrázku 1A identifikovaný whewellit Ca(C2O4) · H2O. Rozdielne sfarbenie koncentrických vrstiev je spôsobené odlišnou koncentráciou Ca. Whewellit bol určený dvoma spôsobmi:
a) namerané spektrum bolo porovnané s databázou ATRIR – Inorganics 1 – Bio-Rad Sadtler a na základe najvyššej zhody určený whewellit (obrázok 2),
b) bol identifikovaný whewellit na základe prítomnosti funkčných skupín charakteristických pre tento minerál. Vibrácie s σ = 652, 3 000 – 3 500 cm–1 reprezentujú H2O. Absorpčné maximum s σ = 779 cm–1 je charakteristickou vibráciou C–H väzby a vibrácie skupín C=O a C–O sa prejavujú v miestach s σ = 1 313 cm–1, resp. σ = 1 606 cm–1.
Vo vzorke na obrázku 1B boli svetlé koncentrické vrstvy tvorené dihydrátom kys. etándiovej C2H2O4 · 2H2O, tmavé časti tvoril whewellit Ca(C2O4) · H2O. Výsledok merania zobrazuje obrázok 3. Vibrácie s σ = 915 a 1 539 cm–1 zodpovedajú NH2 skupine. Absorpčné maximum s σ = 1 316 cm–1 patrí amidovej C–N skupine. Vibrácia s σ = 1 457 cm–1 reprezentuje CH2 skupinu. Karboxylová dvojitá C=O väzba je vyjadrená vibráciou s σ = 1 743 cm–1. Ostatné absorpčné maximá patria whewellitu.
Metódou RAMAN (obrázok 4) bola zistená prítomnosť dahlitu Ca5(PO4,CO3)3(OH) (obrázok 3) identifikáciou vibrácií fosforečnanových (PO4)–3 molekúl v miestach s σ = 433, 583, 961, 1026 cm–1. Absorpčné maximum s σ = 1 099 cm–1 je charakteristické pre (CO3)2– skupinu a vibrácia s σ = 1 565 cm–1 je identifikačná pre amidovú C–N–H skupinu. Vibrácie sú typické pre dahlit.
Prášková difrakčná analýza (PXRD)
Obrázok 5 zobrazuje difrakčný záznam struvitu (NH4) Mg(PO4) · 6H2O a porovnanie údajov s referenčným spektrom pre struvit získané z publikovaných priemerných hodnôt(3-6).
Elektrónová mikroskopia (SEM)
Na obrázku 6 sú viditeľné prizmatické dypyramidálne kryštály. Tento tvar je typický pre weddellit Ca(C2O4) · 2H2O, aj keď podobné kryštály môže vytvárať aj iný minerál.
Elektrónová mikroanalýza (EDS)
Výsledky EDS analýzy dokumentuje tabuľka 1 a obrázok 7. Tabuľka 1 zobrazuje zastúpenie prvkov a oxidov na vybraných miestach vzorky. Zo získaných údajov predpokladáme na základe stechiometrických výpočtov a porovnania s databázou(7) vznik nasledujúcich minerálov: oxid vápenatý CaO, kremeň SiO2 a malé množstvá apatitu Ca5(PO4)3(OH) a anhydritu CaSO4. V miestach (C a D) s dominantným obsahom N predpokladáme vznik bližšie nešpecifikovanej organickej zložky a kremeňa SiO2. Obrázok 7 zachytáva rozmiestnenie prvkov vo vzorke a ich vzájomnú afinitu. N a Ca preukazujú vysokú afinitu k O, Si sa ukladá v okrajových čas-tiach NO a CaO tvorí samostatnú jednotku.
Diskusia a záver
Metódu morfologických štúdií využívame ako doplnkovú podobne ako iní autori (8). Výhodou je nízka cena analýzy, jednoduchosť obsluhy, nenáročné hodnotenie výsledkov a krátky čas merania (do 10 min.). Ak na povrchu konkrementu nie sú dostatočne vyvinuté kryštálové tvary, metóda nepostačuje na presnú analýzu konkrementov.
Metóda FTIR spĺňa predpoklady na rutinné používanie a považujeme ju za najlepšiu metódu na analýzu konkrementov(1,9). Poskytuje údaje na semikvantitatívnej úrovni (má vysokú špecificitu a senzitivitu) a minimalizuje množstvo chýb v porovnaní s chemickou titračnou analýzou(10,11). Je relatívne lacná (15 €/analýza)(12), jednoduchá na obsluhu, hodnotenie výsledkov je stredne náročné, vzorka vyžaduje homogenizáciu a meranie trvá < 10 min. Namerané hodnoty sú podobné ako publikované údaje(13,14).
RAMAN poskytuje v porovnaní s FTIR výsledky na kvantitatívnej úrovni so senzitivitou 96,3 % a špecificitou 98,5 – 99,5 %(15). Cena analýzy je 17 €/vzorku(16), merania možno robiť bodovo, vzorky nevyžadujú špeciálnu úpravu a analýza aj následné hodnotenie výsledkov sú stredne náročné. Nevýhodou je dĺžka merania, ktorá môže byť v rozmedzí 10 – 180 min. Na použitie metódy RAMAN a FTIR postačuje množstvo vzorky ≥ 0,5 mm3(17) a metódy sú vhodné na analýzu liekových a iných menej častých konkrementov. Hodnoty a intenzita vibrácií sú totožné sa zhodujú s meraniami iných autorov(18).
PXRD analýza je kvalitná kvantitatívna metóda na identifikácii štruktúry kryštalickej látky. Meranie trvá 20 – 180 min a predlžuje sa s klesajúcou hmotnosťou vzorky. Cena analýzy je 50 €/vzorku(15), konkrement je potrebné homogenizovať, analýza je stredne náročná a hodnotenie výsledkov náročné. Nevýhodou je nemožnosť merania amorfných konkrementov(19,20). Namerané hodnoty sú dostatočne podobné priemerným hodnotám z doposiaľ publikovaných prác v rámci databázy AMCSD(21).
Metóda SEM poskytuje fotografie vo vysokom rozlíšení (dokáže rozlíšiť komponenty s veľkosťou od 1 nm). Dĺžka analýzy stúpa so zvyšovaním chemickej heterogenity konkrementu a trvá 20 – 120 min. Cena 1 analýzy je 20 €(16), je potrebné naparenie vzorky uhlíkom, je náročná na obsluhu aj hodnotenie výsledkov(22,23). Kryštály na SEM fotografii sú tvarom podobné kryštálom weddellitu z iných publikácií(24) a databáz(25).
Metóda EDS ponúka kvantitatívne výsledky chemického zloženia a distribúciu vybraných prvkov. Dĺžka analýzy (30 – 120 min.) podobne ako pri SEM stúpa chemickou heterogenitou konkrementu. Povrch vzorky je potrebné upraviť, aby bol hladký, a napariť uhlíkom. Cena 1 analýzy je 20 €, meranie a vyhodnocovanie výsledkov je relatívne náročné(16,23). Výsledky EDS tabuľky pre jednotlivé merané body sú pri porovnaní s databázou dostatočne zhodné(7). Obrázok 7 zobrazuje rozloženie prvkov a ich vzájomnú afinitu a pomáha lepšie pochopiť vznik konkrementu.
V porovnaní so zastaranou(1) chemickou titračnou analýzou sú všetky opísané metódy výskumu močových konkrementov kvalitatívne lepšie. Nedochádza k takému vysokému množstvu chýb – falošne pozitívnym a falošne negatívnym výsledkom. V slovenských laboratóriách vždy prevažuje používanie chemickej titračnej analýzy. Týmto sme chceli ponúknuť iné, spoľahlivejšie možnosti analýz močových konkrementov.
Grantová podpora
Výskum bol podporený grantmi KEGA 008UPJŠ-4/2020, KEGA 010UPJŠ-4/2021 a VVGS VUaVP35 2020-1653.
LITERATÚRA
1. Türk C, Neisius A, Petrik A, et al. EAU Guidelines on Urolithiasis. 2021st ed. EAU Guidelines Office; 2021.
2. Gilad R, Williams JC, Usman KD, et al. Interpreting the results of chemical stone analysis in the era of modern stone analysis techniques. J Nephrol 2017; 30(1): 135-140.
3. Ferraris G, Fuess H, Joswig W. Neutron diffraction study of MgN-H4PO4.6H2O (struvite) and survey of water molecules donating short hydrogen bonds 1986; 42(3): 253-258.
4. Mathew M, Schroeder LW, IUCr. Crystal structure of a struvite analogue, MgKPO4.6H2O. Acta Cryst 1979; 35(1): 11-13.
5. Whitaker A, Jeffery JW, IUCr. The crystal structure of struvite, MgN-H4PO4.6H2O. Acta Cryst 1970; 26(10): 1429-1440.
6. Graeser S, Postl W, Bojar H-PB, et al. Struvite-(K), KMgPO46H2O, the potassium equivalent of struvite a new mineral. Eur J Mineral 2008; 20(4): 629-633
7. http://webmineral.com/chemical.shtml
8. Cruz-May TN, Herrera A, Rodríguez-Hernández J, et al. Structural and morphological characterization of kidney stones in patients from the Yu-catan Maya population. J Mol Struct 2021; 1235: 130267.
9. Kravdal G, Helgø D, Moe MK. Infrared spectroscopy is the gold standard for kidney stone analysis. Tidsskr Den Nor legeforening 2015; 135(4): 313-314.
10. Khan AH, Imran S, Talati J, et al. Fourier transform infrared spectroscopy for analysis of kidney stones. Investig Clin Urol 2018; 59(1): 32-37.
11. Primiano A, Persichilli S, Gambaro G, et al. FT-IR Analysis of Urinary Stones: A Helpful Tool for Clinician Comparison with the Chemical Spot Test. Dis Markers 2014; 2014: 1-5.
12. https://www.ruvzke.sk/sites/default/files/cennik/cennik.pdf
13. Sekkoum K, Cheriti A, Taleb S, et al. FTIR spectroscopic study of human urinary stones from El Bayadh district (Algeria). Arab J Chem 2016; 9(3): 330-334.
14. Muthuselvi C, Arunkumar A, Rajaperumal G. Growth and Characterization of Oxalic Acid Doped with Tryptophan Crystal for Antimicrobial Activity. Chem Sin 2016; 7(4): 55-62.
15. Cui X, Zhao Z, Zhang G, et al. Analysis and classification of kidney stones based on Raman spectroscopy. Biomed Opt Express 2018; 9(9): 4175.
16. http://www.geo.sav.sk/wp-content/uploads/Cennik-UVZ-SAV.pdf.
17. Castiglione V, Sacré PY, Cavalier E, et al. Raman chemical imaging, a new tool in kidney stone structure analysis: Case-study and comparison to Fourier Transform Infrared spectroscopy. PLoS One 2018; 13(8).
18. Kalimullina AR, Pisareva EV, Timchenko EV, et al. Experimental studies of hydroxyapatite by Raman spectroscopy. J Opt Technol 2018; 85(3): 130-135.
19. Uvarov V, Popov I, Shapur N, et al. X-ray diffraction and SEM study of kidney stones in Israel: Quantitative analysis, crystallite size determination, and statistical characterization. Environ Geochem Health 2011; 33(6): 613-622.
20. Srivastava A, Swain KK, Vashisht B, et al. Studies of kidney stones using INAA, EDXRF and XRD techniques. J Radioanal Nucl Chem 2013; 300: 191-194.
21. Downs RT, Hall-Wallace M. The American Mineralogist Crystal Structure Database. Am Mineral 2003; 88: 247-250.
22. Singh VK, Rai PK. Kidney stone analysis techniques and the role of major and trace elements on their pathogenesis: a review. Biophys Rev 2014; 6(3-4): 291-310.
23. Racek M, Racek J, Hupáková I. Scanning electron microscopy in analysis of urinary stones. Scand J Clin Lab Invest 2019; 79(3): 208-217.
24. Saffo MB, Lowenstam HA. Calcareous Deposits in the Renal Sac of a Molgulid Tunicate. Science 1978; 200(4346): 1166-1168.
25. https://www.mindat.org/gm/4254
