*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom 
PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

V roku 1997  bola v periférnej  krvi tehotných žien objavená voľná DNA pochádzajúca z plodu(1). Táto DNA však nie je priamo uvoľňovaná plodom, ale bunkami cytotrofoblastu placenty, ktoré odumrú v procese apoptózy(2). NIPT predstavuje pokročilý skríningový test, nie však diagnostický test, pretože môže  viesť k falošne pozitívnym  alebo  menej často k falošne negatívnym výsledkom. Práve  placentárny pôvod  a fenomén placentárneho mozaicizmu zodpovedajú za malú mieru diskordantných výsledkov NIPT a skutočného karyotypu plodu a sú  jednou  z biologických príčin nesprávneho výsledku NIPT(3). Ďalšou z príčin falošne pozitívnych výsledkov NIPT je syndróm miznúceho dvojčaťa, pretože u miznúceho dvojčaťa je vyšší výskyt aneuploidií a príslušná časť placenty uvoľňuje aberantnú DNA(11). Nízky podiel DNA plodu (menej  ako 4 %) môže  byť príčinou falošne negatívneho výsledku. DNA získaná z plazmy  je zmesou dominujúcej materskej DNA a DNA plodu, ktorá predstavuje priemerne len okolo 10 – 20 % medzi 10. a 21. týždňom tehotenstva(4). Výsledok  NIPT môže byť preto  ovplyvnený  aj aberantným genotypom matky (na- pr. mozaicizmus). Až v roku 2008  bola  prvýkrát  publikovaná  nová  metóda analyzujúca cirkulujúcu  DNA v krvi tehotnej  pomocou sekvenátorov novej  generácie, vďaka  ktorej bolo možné s vysokou  spoľahlivosťou odlíšiť trizomické plody od euploidných(5). Bol založený na celogenómovom sekvenovaní voľnej cirkulujúcej  DNA, priradení  sekvencií k jednotlivým chromozómom a následnému porovnaniu pomerov sledovaných a referenčných chromozómov s pomermi zistenými pre súpravu vzoriek euploidných tehotenstiev. Prvý komerčne dostupný NIPT test prišiel v roku 2011 a odvtedy došlo k veľkému  nárastu počtu  vyšetrených tehotných, ako  aj k dostupnosti rôznych NIPT(6). Prax ukázala prínos  NIPT metód vo vysokej citlivosti  a špecificity častých chromozómo- vých porúch plodu v porovnaní so štandardným skríningom a NIPT predstavuje najspoľahlivejšiu metódu v prípade, že tehotná nie je ochotná podstúpiť amniocentézu(7).

NIPT testy  však nesú predovšetkým genomickú informáciu o tehotnej žene.  Práca Bianchi a kol.(7) poukazuje na zachytenie ešte  neidentifikovaných desiatich prípadov materskej malignity u tehotných žien v rámci  poskytovania komerčného NIPT testu,  ktoré  boli pri následnom klinickom manažmente aj potvrdené. Malígne  bunky  totiž do  obehu uvoľňujú DNA podobne ako placenta, pričom  tumorové tkanivo je často tvorené bunkami s viacpočetnými chromozómovými  aberáciami. Malignita  však  nie je jedinou možnou príčinou  zachytenia abnormálneho NIPT chromozómového profilu. Chan a spol.(8) v roku 2015 poukázali na to že aj systémový  lupus  erythematosus (SLE) spôsobuje viacpočetné  aberantné chromozómové artefakty pri celogenómovej analýze DNA z placenty. Táto práca poukazuje na zachytený prípad  tehotnej s prítomnými viacpočetnými chromozómovými aberáciami zistenými pomocou NIPT testu(9) s rozborom možných príčin. Práve  schopnosť zachytiť iné aberácie okrem  testovaných vnímame ako  hlavnú výhodu celogenómového prístupu pri NIPT skríningu.

Materiál a metódy

U pacientky vo veku 32 rokov, po in vitro fertilizácii  bol indikovaný  NIPT test. Odberová skúmavka s periférnou krvou odobratou do EDTA bola prepravená do laboratória a do 24 hodín  z nej bola  získaná čistá frakcia  plazmy.  Z plazmy bola  izolovaná celková  DNA pomocou kitu DNA Blood Mini kit (Qiagen, DE) a celý výťažok bol použitý  na prípravu fragmentovej sekvenačnej knižnice  s kitom  TruSeq  Nano (Illumina, USA) na účely masívne paralelného sekvenovania na sekvenátore Illumina MiSeq. Vykonané bolo párové sekvenovanie s dĺžkou  čítania  75bp.  Získané dáta  zo sekvenovania boli spracované pomocou bioinformatického expertného nástroja NIPT-APP, ktorý zabezpečil kvalitatívne filtrovanie dát, mapovanie čítania k referenčnému ľudskému genómu verzie hg19, zisteniu početností čítania pre jednotlivé chromozómy, ako aj pre rovnomerné segmenty chromozómov, ktoré pomocou vlastného algoritmu boli porovnané s normálnymi početnosťami referenčných vzoriek.  Na základe porovnania vzoriek s referenčnými hodnotami bolo stanovené Z skóre  pre analyzované chromozómy pomocou vyvinutého algoritmu Multinomial. Na účely kontroly validity výsledkov boli výsledky vizualizované aj formou grafickej reprezentácie chromozómov  na subchromozómovej úrovni pomocou nástroja Circos(10). Vzhľadom na výsledok bol s odstupom dvoch týždňov vykonaný opakovaný odber  s použitím rovnakého postupu.

Výsledky

Pri prvej NIPT analýze vzorky sme získali 6,9 milióna párových čítaní, ktoré  sa unikátne mapovali na genóm vo verzii GRCh37. Bola zistená pozitivita na trizómiu chromozómu 18 (Z skóre  > 6) a zároveň hodnoty Z skóre chromozómov 21 a 13 boli v sivom  pásme (Z skóre  medzi  2,5 a 4), čo je neštandardné (obrázok 1). Výsledok  po 2. odbere bol rovnaký. Pomocou nástroja Circos sme hodnotili distribúciu čítania v rámci  všetkých autozómov (obrázok 2). Pozorovali sme prítomnosť viacpočetných subchromozómových aberácií (mikrodelécie a duplikácie) na každom z chromozómov (obrázok  1). Pacientka bola  na základe výsledkov  indikovaná na  amniocentézu.

Diskusia a záver

Neinvazívne prenatálne testy v praxi preukázali vysokú citlivosť a špecificitu pri odhaľovaní najčastejších aneuploidií plodu  analýzy  voľnej DNA plodu  v periférnej  krvi tehotných žien. Od pôvodného názoru expertov na prenatálnu starostlivosť pri využití NIPT testu ako alternatívy štandardného skríningu pre tehotné s vyšším  rizikom plodu s Downovým syndrómom badať  posun k názoru vhodnosti nasadenia testu ako prvej voľby skríningu  na najčastejšie aneuploidie plodu. No skupina testov založených na celogenómovom skenovaní dokáže poskytnúť  doplňujúce informácie, ktoré  sa týkajú samotnej tehotnej ženy.

Pri poskytovaní NIPT testu v našom laboratóriu sme zachytili prípad tehotnej, ktorá mala abnormálny výsledok NIPT testu a vo vizualizácii distribúcie čítania pre všetky chromozómy sme pozorovali veľký počet subchromozómových odchýlok (duplikácií aj delécií). Okultná malignita je jedným z možných vysvetlení  získania tohto  neštandardného výsledku.

Masa malígneho tumoru môže  mať všetky  alebo subpopulácie  buniek  s prítomnými subchromozómovými aberáciami, ktoré v dôsledku poruchy  v kontrolných a opravných mechanizmoch bunky prežívajú  a množia sa. Práve pri rozpade takýchto buniek  sa do  cirkulácie  uvoľňujú aberantné DNA tumoru a menia  tak relatívne  zastúpenie fragmentov v aberantných oblastiach. Viaceré  práce uvádzajú zachytenie takýchto  prípadov skrytej  malignity  v skorom štádiu v rámci NIPT, ktoré  boli následne potvrdené, lokalizované, prípadne aj liečené pri ďalšom klinickom manažmente(7).

Príčinou  zisteného aberantného profilu však  môže  byť aj SLE a napriek  zatiaľ nedostupným informáciám z odbornej literatúry  možno predpokladať, že aj iné autoimunitné ochorenia  môžu  spôsobiť podobný výsledok.  Pri pozorovaní abnormálneho profilu je potrebné vylúčiť SLE alebo  iné autoimunitné ochorenia u pacientky. V anamnéze však pacientka neuviedla SLE.

V analyzovanom prípade treba  vziať do úvahy aj tretiu alternatívnu príčinu. Tehotná žena  totiž podstúpila procedúru in vitro fertilizácie, pričom boli implantované dve embryá, jedno z nich neprosperovalo. Zdrojom aberantnej DNA pozorovanej v NIPT teste by teda  mohlo byť aj jedno z embryí.

Na definitívne  stanovenie príčiny pozorovaného abnormálneho profilu  je  potrebné vykonať  doplňujúce vyšetrenia a získať ďalšie anamnestické údaje.  Kľúčový je výsledok z analýzy  vzorky získanej z amniocentézy, vďaka čomu  bude možné vylúčiť aberácie prítomné u prosperujúceho plodu. Vzhľadom  na odber  z vnútra plodového obalu prosperujúceho dvojčaťa pravdepodobne nebude možné zistiť, či aberantná DNA zachytená v periférnej krvi pochádza z druhého embrya. Ten však pacientka odmieta. Vzorka placenty získaná pomocou CVS a jej karyotypová analýza by mohla  byť vhodnou metódou na stanovenie embryonálneho pôvodu aberantnej DNA. Definitívne  však možno embryonálny pôvod  abe- rantnej  DNA potvrdiť alebo vylúčiť až po ukončení gravidity podľa vymiznutia aberantného signálu. Z anamnézy pacientky alebo špecifickými vyšetreniami bude  možné preveriť hypotézu o prítomnosti SLE. Po vylúčení predchádzajúcich príčin by bolo potrebné vyšetriť okultnú malignitu.

Záver

Celogenómový prístup pri neinvazívnom testovaní na najčastejšie chromozómové poruchy  môže byť významným zdrojom informácií  o zdravotnom stave tehotných žien a po- môcť  tak  pri odhaľovaní závažných patologických fenoménov. Identifikovali sme prípad s viacpočetnými chromozómovými aberáciami s viacerými  možnými príčinami  vzniku, no na stanovenie ich príčiny je potrebný vhodný algoritmus diferenciálnej diagnostiky.

Literatúra
1. Lo YM, Corbetta N, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997; 350: 485-487.
2. Faas BH, de Ligt J, Janssen I, et al. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using massively parallel sequencing-byligation and evidence that cell-free fetal DNA in the maternal plasma originates from cytotrophoblastic cells. Expert Opin Biol Ther 2012; 12: S19-S26.
3. Grati FR, Malvestiti F, Ferreira JC, et al. Fetoplacental mosaicism: potential implications for false-positive and false-negative noninvasive prenatal screening results. Genet Med 2014; 16(8): 620-4.
4. Taglauer ES, Wilkins-Haug L, Bianchi DW. Review: cell-free fetal DNA in the maternal circulation as an indication of placental health and disease. Placenta 2014; 35: Suppl S64-8.
5. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, et al. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105(42): 16266-71.
6. Bianchi DW, Wilkins-Haug L. Integration of Noninvasive DNA Testing for Aneuploidy into Prenatal Care: What Has Happened Since the Rubber Met the Road? Clinical Chemistry 2014; 60(1): 78-87.
7. Bianchi DW, Chudova D, Sehnert AJ, et al. Noninvasive Prenatal Testing and Incidental Detection of Occult Maternal Malignancies. JAMA 2015; 314(2): 162-169.
8. Chan RWY, Jiang P, Peng Z, et al. Plasma DNA aberrations in systemic lupus erythematosus revealed by genomic and methylomic sequencing. Proc Natl Acad Sci 2015; 111: E5302–E5311.
9. Minarik G, Repiska G, Hyblova M, et al. Utilization of Benchtop Next Generation Sequencing Platforms Ion Torrent PGM and MiSeq in Noninvasive Prenatal Testing for Chromosome 21 Trisomy and Testing of Impact
of In Silico and Physical Size Selection on Its Analytical Performance. PLoS One 2015;10(12): e0144811.
10. Krzywinski M, Schein J, Birol I, et al. Circos: an information aesthetic for comparative genomics. Genome Res 2009; 19(9): 1639-45.
11. Curnow KJ, Wilkins-Haug L, Ryan A, et al. Detection of triploid, molar, and vanishing twin pregnancies by a single-nucleotide polymorphism-based noninvasive prenatal test. Am J Obstet Gynecol 2015; 212(1): 79.e1-9.