*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf attachment at the end of the paper.

Úvod

Napriek odhadovanému predpokladu, že zriedkavými ochoreniami trpí na Slovensku až 300 000 ľudí(1), molekulová podstata týchto ochorení je mnohokrát unikátna, a preto ich diagnostika vyžaduje maximálne personalizovaný prístup. Lyzozómové ochorenia (z angl. Lysosomal Storage Disorders – LSD) tvoria širokú skupinu zriedkavých dedičných metabolických ochorení, v rámci ktorej ich rozdeľujeme na:

A.) poruchy v štiepení a degradácii glykánov a glykoproteínov (napr. alfa- a beta-manozidóza, sialidóza), glykolipidov (napr. GM1 gangliozidóza, Gaucherova a Fabryho choroba), glykozaminoglykánov (napr. MPS I-III) a mukopolysacharidov (napr. MPS IV), B.) poruchy v štiepení a degradácii lipidov – sfingolipidov (napr. Niemann Pick typu A alebo B) a triacylglyceridov, C.) poruchy v degradácii proteínov a D.) poruchy lyzozómových transportných proteínov (napr. mukolipidózy III a IV)(2).

Jednotlivé LSD sú sprevádzané hromadením nedegradovaných produktov v tkanivách a glykokonjugátov v moči v dôsledku nedostatočnej aktivity lyzozómových degradačných enzýmov (hydroláz). Niektoré z nich, napr. voľné oligosacharidy obsiahnuté v moči (z angl. free oligosaccharides – FOS), majú charakteristický profil, špecifický pre dané ochorenie. FOS možno detegovať rýchlou, presnou a neinvazívnou diagnostickou metódou – tandemovou hmotnostnou spektrometriou MALDI-TOF/TOF, ktorá presne definuje štruktúrne zloženie nahromadených oligosacharidov v moči a predstavuje alternatívu tradičných skríningových techník, ako je metóda tenkovrstvovej chromatografie (TLC), ktorej identifikácia metabolitov spočíva v porovnávaní pohyblivosti FOS nachádzajúcich sa vo vzorke so štandardnou zmesou oligosacharidov s 1 – 9 hexózovými jednotkami. Táto metóda je vhodným prvotným skríningovým prístupom, v prípade hraničného, resp. pozitívneho výsledku je však ďalšia charak- terizácia pozorovaného profilu esenciálna. Na rozlíšenie, či kumulované FOS pochádzajú zo stravy alebo sú tvorené patologickými, špecifickými metabolitmi, predstavuje vhodné využitie vysokorobustná MALDI TOF/TOF analýza.

LSD ochorenia sú typické multisystémovými klinickými príznakmi s trvalou progresiou v dôsledku neustáleho hromadenia nedegradovaného substrátu. Niektoré príznaky sa môžu spočiatku javiť ako nevýznamné, resp. typické pre inú či bežnejšiu chorobu (napríklad vracanie, hypoglykémia, hypotónia, letargia, kŕče, hluchota, všeobecné neprospievanie, psychomotorická retardácia) a môžu sa prejaviť v akomkoľvek veku, od fetálneho obdobia až po senium. Kombinovaná prevalencia LSD predstavuje až 1 : 5 000 živonarodených(3), a preto je ich včasná a spoľahlivá diagnostika esenciálnym faktorom ovplyvňujúcim život pacientov a ich rodín. Oddelenie glykobiológie Chemického ústavu SAV  v spolupráci s Centrom dedičných metabolických porúch NÚDCH v Bratislave zaviedlo a optimalizovalo analytickú metódu na stanovenie profilov voľných oligosacharidov v moči, ktorá v porovnaní s tradičnými konvenčnými metódami disponuje vysokou presnosťou, špecificitou, citlivosťou a môže byť použitá okrem prvotného diagnostického prístupu aj v prípade monitorovania účinnosti terapie.

Materiál a metóda

Vzorky moču odobraté od pacientov s rôznymi lyzozómovými ochoreniami (beta-manozidóza, alfa-manozidóza, rôzne typy mukopolysacharidóz, mukolipidóza, gangliozidóza I. a II. typu, sialidóza) a glykogenózou II. typu (Pompeho choroba), resp. od zdravých fyziologických jedincov ako negatívnych kontrol, boli uchovávané pri –20 °C až do ich spracovania. Riedený moč bol po odstránení nerozpustného sedimentu lyofilizovaný a takto vysušené vzorky sa derivatizovali permetyláciou (PerMe) s jódmetánom v zásaditom prostredí NaOH, ktorého nadbytok bol následne odstránený extrakciou s chloroformom. Pripravené PerMe FOS sa po vysušení rekonštituovali do 50 % metanolu a v pomere 1 : 1 s matricou 2,5-dihydroxybenzoovou kyselinou sa naniesli na MALDI platničku. Analýza PerMe FOS sa uskutočnila na tandemovom hmotnostnom spektrometri (UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF, Bruker Daltonics, MA, USA) v reflektrónovom pozitívnom iónovom móde. Postanalytická interpretácia nameraných spektier bola spracovaná softvérom GlycoWorkbench a ProteinScape 3. 0.

Výsledky

Analýzou permetylovaných FOS boli stanovené charakteristické močové profily pre 7 vybraných LSD. V spektrách FOS kontrolných vzoriek (zdravé kontroly) bolo pozorovaných niekoľko štandardných voľných oligosacharidov, ktoré sú prítomné medzi všetkými vekovými skupinami, najmä m/z 838,40, 879,43, 1 240,61 a 1 274,62. V spektrách novorodencov na materskom mlieku sa potvrdili špecifické FOS pochádzajúce z materského mlieka. Získané výsledky analýz profilov FOS sú v zhode s dátami publikovanými v litera- túre(4,5).

FOS reprezentatívnych profilov LSD (obrázok 1), získané analýzou MALDI TOF/TOF permetylovaných oligosacharidov obsiahnutých v moči pacientov, predstavujú typické zloženie oligosacharidov vyplývajúce z nefunkčnosti alebo nižšej aktivity špecifických lyzozómových hydroláz:

• Alfa-manozidóza (MAN2B1) – v dôsledku tejto poruchy katabolizmu glykokonjugátov dochádza k akumulácii viacjednotkových manóz naviazaných na β-N-acetylhexozamín z redukujúceho konca
• Beta-manozidóza (MANBA) – prítomné charakteristické spektrum s nadbytkom disacharidu Man(β1-4)GlcNAc a sialylovaného trisacharidu NeuAc(α2-6)Man(β1-4)Glc- NAc vzniká pravdepodobne netypickou sialyzáciou prekurzora Man(β1-4)GlcNAc. V prípade diagnostiky beta-manozidózy je dôležité rozlíšiť štruktúry týchto špecifických dia trisacharidov od tých, ktoré môžu byť exogénneho pôvodu (laktóza, sialyllaktóza) a vylúčiť tak falošne pozitívny výsledok.
• Pompeho choroba (GAA) – v dôsledku poruchy degradácie glykogénu na monoglukózové jednotky dochádza k akumulácii polyhexóz od tetrasacharidu Glc4 (Gl- cα1-6Glcα1-4Glcα1-4Glc) po
• Gangliozidóza GM2 ((HEXA) (HEXB)) – charakteristický profil FOS reprezentujú oligosacharidy s terminálnymi Gl- cNAc v dôsledku zníženej degradácie β-N-acetylgalaktózamínu z neredukujúceho konca oligosacharidu nefunkčnou hexozaminidázou.
  • Gangliozidóza GM1 (GLB1) – charakteristické spektrum v dôsledku nefunkčnej beta-galaktozidázy predstavuje akumuláciu galaktozylovaných FOS. Pozorovaný rozdiel v GM1 a GM2 FOS profiloch jednoznačne poukazuje na konkrétne miesto prerušenia príslušnej metabolickej dráhy, a tak umožňuje tieto dve gangliozidózy špecificky rozlíšiť.
  • Sialidóza (NEU1) – v hmotnostnom spektre moču sú prítomné dominantné sialylované Profil je na prvý pohľad podobný ako pri mukolipidóze ML2, v prípade sialidózy sú však všetky kumulované oligosacharidy zakončené kyselinou sialovou.

• Diskusia

  Analýza voľných oligosacharidov v moči 7 referenčných vzoriek LSD pacientov s využitím hmotnostnej spektrometrie (MALDI TOF/TOF) identifikovala štruktúrne zloženie prítomných oligosacharidov. Určením presnej štruktúry oligosacharidov v súčinnosti s používanými skríningovými technikami je účinná a rýchla metóda v diagnostike vybraných lyzozómových ochorení pred následnou molekulárnogenetickou analýzou. Jej výhoda, okrem vysokej citlivosti a presnosti, spočíva v predpoklade jednoduchej automatizácie na 96- i viacjamkový formát, čo môže byť využité v prípade celoplošného ale- bo novorodeneckého skríningu.

  Od dostupnosti vzoriek závisí profilovanie a vytváranie referenčných databánk voľných oligosacharidov obsiahnutých vo vzorkách pacientov týchto ochorení. Charakterizujeme prítomnosť špecifických voľných oligosacharidov v moči siedmich geneticky potvrdených LSD ochorení získaných z Centra dedičných metabolických porúch NÚDCH v Bratislave. Z medzinárodných databáz poznáme niekoľko ďalších LSD referenčných spektier, napr. pre fukozidózu, aspartylglukózaminúriu, Gaucherovo ochorenie a iné(4,5). Pretože ide o veľ- mi zriedkavé ochorenia, možnosť pridávať referenčné FOS profily je obmedzená v závislosti od počtu LSD diagnostikovaných pacientov. Napríklad k dnešnému dňu na Slovensku nie je žiadny pacient trpiaci fukozidózou. S neustále sa rozvíjajúcim spoľahlivým skríningom a včasným záchytom pacientov sa však postupne budú môcť pridávať FOS profily všetkých 60 LSD ochorení a bude sa môcť vypracovať podrobná štúdia, ktorá by pojednávala aj výsledky profilov FOS v závislosti od veku, progresu ochorenia, a pod. Spolupráca medzi lekármi a vedeckými laboratóriami prispieva k verifikácii a dôkladnejšiemu objasneniu nejednoznačných, resp. hraničných nálezov v selektívnom skríningu pre suspektné LSD.

   

  Záver

  Tenkovrstvová chromatografia (TLC) je v súčasnosti v klinických laboratóriách primárna a štandardne používaná metóda na analýzu voľných oligosacharidov v moči. TLC má limity v špecificite a citlivosti analýz a neposkytuje štruktúrnu analýzu oligosacharidov FOS, ktorá je často v diagnostike lyzozómových ochorení nevyhnutná. V sérii niekoľkých LSD ochorení a kontrolných vzoriek moču sme aplikovali metódy hmotnostnej spektrometrie MALDI TOF/TOF a určili sme štruktúry dominantných oligosacharidov pre vybrané subtypy. Prezentovaná metóda je významným prínosom v diagnostike LSD, urýchľuje rozhodovací diagnostický proces a v súčasnosti je už aj na Slovensku dostupná pre pacientov s podozrením na niektorú z uvedených lyzozómových chorôb.

   

  Konflikt záujmov: Autori deklarujú, že nemajú žiadny konflikt záujmov, a zároveň čestne vyhlasujú, že práca nebola publikovaná v inom periodiku.

   

  Poďakovanie: Táto práca bola podporená Ministerstvom zdravotníctva SR v rámci projektu s registračným číslom 2019/7-CHÚSAV-4 a grantom č. 2/0130/18 Slovenskej grantovej agentúry pre vedu VEGA.

  Mukolipidóza ML2 (GNPTAB) – v spektre sa pozoruje hromadenie rôznych FOS s variabilnými terminálnymi monosacharidmi – manózami, galaktózami či sialovými kyselinami v dôsledku nedostatočnej funkcie niektorých lyzozómových hydroláz, sialidáz, beta-galaktozidáz alebo alfa-manozidáz, enzýmov využívajúcich produkty GlcNAc-fosfotransferázy (GNTP) – fosforylované manózy.

       LITERATÚRA

1. https://www.zriedkavsk/zakladny-prehlad/co-su-zriedkave- choroby/
2. Greiner-Tollesrud OK, Berg T. Lysosomal storage disorders. Lysosomes 2005; 60-73.
3. Schultz ML, Tecedor L, Chang M, et Clarifying lysosomal storage disorders. Trends in Neuroscience 2011; 34: 401-410.

4. Xia B, Asif G, Arthur L, et Oligosaccharide Analysis in Urine by MALDI-TOF Mass Spectrometry for the Diagnosis of Lysosomal Storage Diseases. Clinical Chemistry 2013; 59(9): 1357-1368.
5. Michalski JC, Klein Glycoprotein lysosomal storage disorders: α- and β-mannosidosis, fucosidosis and α-N-acetylgalactosaminidase deficiency. Biochimica et Biophysica Acta 1999; 1455(2-3): 69-84.