*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper. 

Úvod

Klasifikácia založená na biologickom potenciáli patologického bunkového klonu tradične rozlišuje malígne a benígne MG (tabuľka 1). Premalígne štádium ochorenia, tzv. monoklonová gamapatia nejasného významu (monoclonal gammopathy of undetermined significance – MGUS), sa prejavuje len patolo- gickým laboratórnym nálezom M-proteínu. Rozdelenie MG na asymptomatické a symptomatické je založené na prítomnosti známok orgánového poškodenia, ktoré sa detegujú najmä pomocou  laboratórnych nálezov. Diagnostické kritériá mnohopočetného myelómu, najvýznamnejšej MG, sumarizuje tabuľka 2.

Laboratórna diagnostika MG zahŕňa široké spektrum hematologických, biochemických, imunologických, cytotologických a genetických vyšetrení.

Cieľom laboratórnej diagnostiky je:

1. potvrdenie  klonálnej expanzie plazmocytov
2. dôkaz akéhokoľvek orgánového poškodenia
3. vyšetrenie prognostických  markerov – pri voľbe terapie a pri určení dlhodobej prognózy
4. monitorovanie progresie ochorenia alebo účinku liečby

Detekcia monoklonového proteínu

1. Celkové bielkoviny v sére: hyperproteinémia nad 90 g/l môže byť prvou známkou možnej MG.
2.  Imunoglobulíny kvantitatívne: stanovuje sa sumárna koncentrácia polyklonových  aj monoklonových imunoglobulínov (M-Ig). Pri vysokých koncentráciách M-Ig je nutné sérum riediť, čo vedie k nadhodnoteniu stanovenia, najmä pri IgM. U väčšiny pacientov so symptomatickým MM je prítomná supresia polyklonových imunoglobulínov.
3. Elektroforéza sérových bielkovín umožňuje detekciu M-gradientu od veľkosti cca 1,0 g/l. Gradient je najčastejšie tvorený kompletnou molekulou M-Ig alebo len jej stavebnými súčasťami – ľahkými reťazcami.

Denzitometrický odhad veľkosti M-proteínu nekoreluje vždy s kvantitou celkových Ig (rôzna afinita farbiva k monoklonovej bielkovine, nadhodnotenie celkových Ig).
Príčiny falošnej negativity: malé gradienty splývajúce s beta-a alfa2-globulínmi, atypické difúzne gradienty v dôsledku tvorby dimérov alebo polymérov IgM a IgA alebo agregátov IgG, tvorba komplexov M-proteínu s ostatnými bielkovinami séra.
Príčiny falošnej pozitivity: fibrinogén, hemopexín – hemoglobínový komplex.

4. Imunofixačná elektroforéza v sére umožňuje pomocou antisér proti ťažkým a ľahkým reťazcom určiť triedu monoklonového  imu- noglobulínu (G, A, M, prípadne D, E) a antigénny typ ľahkého reťazca (kappa a lambda). Imunofixácia sa vykonáva vždy pri nízkosekrečných formách MG, napríklad AL-amyloidózy, ako aj liečených  pacientov, u ktorých pomocou elektroforézy nie je možné detegovať nízku koncentráciu M-proteínu. Citlivosť metódy  je okolo 0,2 g/l.

5. Voľné ľahké reťazce kappa a lambda v sére (VĽR):  patologický pomer svedčí o prítomnosti klonálnej expanzie plazmocytov alebo ich progenitorov, prípadne o supresii nepostihnutého (uninvolved) ľahkého reťazca v priebehu ochorenia alebo po liečbe. Koncentrácia v sére závisí od rov- nováhy medzi ich produkciou plazmocytmi a obličkovým klírensom. Na posudzovanie monoklonality u pacientov so zníženou GF sa používajú modifikované referenčné intervaly pomeru kappa/lambda (tabuľka 3). Vyšetrenie je indikované najmä v diagnostike MG s tvorbou prevažne voľných ľahkých reťazcov (AL-amyloidóza, ľahkoreťazcový a nesekrečný myelóm), ktorých detekcia pomocou  elektroforézy a imunofixácie je problematická. V skríningu MG je vyšetrenie VĽR v kombinácii s elektroforézou v sére vhodnejšou a citlivejšou metódou, ktorá nahrádza problematický a nepohodlný zber moču (3).

6. Imunofixačná elektroforéza v moči: umožňuje  identifikovať prítomnosť monoklonových  ľahkých reťazcov (Benceova-Jonesovej proteinúria) a intaktného monoklonového  Ig ako prejav neselektívnej glomerulovej proteinúrie pri ťažšom poškodení obličiek. Podľa súčasných odborných odporúčaní na diagnostiku a liečbu MM a príbuzných MG je u všetkých pacientov s diagnostikovaným ochorením požadované aj imunofixačné vyšetrenie 24-hodinového moču (1, 4). Dôkaz patologických koncentrácií v moči (spolu s kvantitou VĽR v sére) má diagnostický význam najmä pri MG, pre ktoré je charakteristická len tvorba VĽR – ľahkoreťazcový myelóm, nesekrečný myelóm, AL-amyloidóza.

7.   Prietoková cytometria: stanovenie percentuálneho zastúpenia, fenotypu a klonality plazmatických buniek (PB) a určenie percentuálneho podielu abnormálnych buniek z celkového počtu PB umožňuje rozlíšenie najmä medzi:

• MGUS, myelómom a reaktívnou plazmocytózou
• IgM myelómom a inými IgM produkujúcich lymfoproliferatívnymi ochoreniami

Najvhodnejšími  identifikátormi plazmatických  buniek sú antigény CD38 a CD138. Na posúdenie patológie jednotlivých subpopulácií PB sa vyžaduje multifarebná  prietoková cytometria  doplnená  aj o ďalšie potenciálne  aberantné markery, ktorá umožňuje  odhaliť aj veľmi malý patologický klon medzi normálnymi PB (5).

Hodnotenie: Nález ≥ 95 % patologických  PB s aberantným fenotypom svedčí o MM (6).

Normálny fenotyp: CD19+CD56-.

Aberantné fenotypy: CD19-CD56+, CD19-CD56-, resp. CD19+CD56+. Medzi ďalšie znaky aberantného fenotypu patrí:

• znížená expresia CD19, CD27, CD38 CD45 a CD81
• zvýšená expresia CD28, CD33, CD56, CD200
• asynchrónna expresia CD20 a CD117

Na určenie klonality sa stanovuje pomer cytoplazmatických ľahkých reťazcov kappa/lambda, ktorý je v polyklonových PB v rozmedzí  0,3 – 3,0. Stanovenie  cytoplazmatickej  expresie reťazcov kappa a lambda je nevyhnutné v nejasných prípadoch, na vylúčenie pacientov bez MG, pri MGUS a asymptomatickom MM, ako aj pri analýze minimálnej  reziduálnej choroby.

Limitácia: V porovnaní s konvenčnou  mikroskopiou je percento  PB detegované prietokovou cytometriou podhodnotené v dôsledku hemodilúcie vzorky kostnej drene a deplécie lipidoadhezívnych plazmocytov.

Dôkaz orgánového postihnutia

Na odhalenie orgánových komplikácií (tabuľka 4) slúžia laboratórne vyšetrenia: kompletný KO, urea, kreatinín, GF, Ca, albumín, LD, CRP, Ig GAM kvantitatívne, VĽR. Nové revidované  kritériá IMGW (international Myeloma  Working Group, 2014) pre diagnostiku mnohopočetného myelómu zahŕňajú 3 nové valido- vané biomarkery, ktoré sa pridávajú k tradičným markerom orgánového postihnutia  a umožnia skupine rýchlo progredujúcich pacientov s asymptomatickým (smoldering) myelómom profitovať z včasnejšej liečby (8).

Prítomnosť aspoň jedného z nasledujúcich troch kritérií postačuje  pre diagnózu MM bez ohľadu na prítomnosť markerov CRAB:

1. zastúpenie  klonálnych  buniek v kostnej dreni ≥ 60 %
2. pomer  postihnutý/nepostihnutý  VĽR ≥ 100
3. viac ako jedna lézia nad 5 mm zistená pomocou  MRI

IMWG upozornila aj na ďalšie sľubné biomarkery, ktoré by v budúcnosti mohli byť súčasťou diagnostických kritérií pre mnohopočetný  myelóm:

• výskyt abnormálneho imunofenotyp plazmatických buniek ≥ 95%;
• imunosupresia normálnych imunoglobulínov;
• progresia asymptomatického myelómu v podobe nárastu M-proteínu o ≥10 % v dvoch po sebe idúcich vyšetreniach v priebehu 6 mesiacov;
• cytogenické subtypy t(4;14), 1q amp alebo del 17p;
• nevysvetlený pokles GF o  ≥25 % plus nárast proteinúrie alebo koncentrácie VĽR v sére.

Vyšetrenie prognostických markerov

1. Medzinárodný  stážovací systém na určovanie klinických štádií myelómu – International Staging System for Multiple Myeloma  (8), je založený na jednoduchých a široko dostupných laboratórnych vyše- treniach – sérových koncentráciách β2-mikroglobulínu  a albumínu (tabuľka 5).
2. Voľné ľahké reťazce kappa a lambda v sére: patologická koncentrácia VĽR je nepriaznivým prognostickým  faktorom pri väčšine  MG, nevynímajúc MGUS (tabuľka  6). Koncentrácia monoklonových VĽR koreluje nielen s veľkosťou nádorovej hmoty, ale aj s rizikom obličkového poškodenia. V monitorovaní priebehu ochorenia alebo efektu liečby sa odporúča okrem pomeru  VĽR sledovať aj absolútnu koncentráciu postihnutého typu reťazca alebo diferenciu medzi postihnutým a ne- postihnutým reťazcom, ktorá lepšie odráža veľkosť nádorovej masy (4).
3. Prietoková cytometria: participuje pri určení rizika progresie u pacientov s MGUS a asymptomatickým mnohopočetným  myelómom detekciou percentuálneho podielu abnormálnych PB z celkového počtu plazmatických buniek. Nález ≥ 95 % patologických PB s abnormálnym fenotypom svedčí o transformácii MGUS do MM.
4. Prognostické cytogenetické markery: MM sa vyznačuje špecifickými abnormalitami chromozómov, ktoré umožňujú rizikovú stratifikáciu, najmä pacientov liečených vysokodávkovanou chemoterapiou s podporou autológnej transplantácie kmeňových buniek a biologickej liečby (tabuľka 7). Minimálny panel odporúčaných FISH vyšetrení u pacientov s myelómom (tzv. „high-risk panel“) zahŕňa:
   – translokácie t(4;14)(p16;q32), t(14;16)(q32;q23)
   – delécia TP53 [del(17)(p13)]
   – zisk/amplifikácia v oblasti 1q21 (CKS1B)
   Súčasná pozitivita translokácie a najmenej jednej ďalšej chromozómovej abnormality definuje vysokorizikových pacientov s nepriaznivou prognózou. Rozšírený panel cytogenických prognostických markerov sa používa u pacientov liečených imunomodulačnými liekmi a inhibítormi proteazómu (1).

Monitorovanie liečby

Medzinárodné kritériá IMWG (International Myeloma Working Group, 2006) na hodnotenie liečebnej odpovede zahŕňajú aj nasledovné laboratórne parametre (9):

1. M-gradient  v elektroforéze:  Používa sa prípade tzv. merateľnej choroby, ktorá je definovaná  ako M-gradient nad 10 g/l v sére a/alebo  nad 0,2 g/24  hod. v moči. Idiotyp M-proteínu sa v priebehu vývoja myelómu nemení, hoci ojedinele, najmä pri relapse ochorenia môžu myelómové  bunky stratiť schopnosť  tvorby ťažkých reťazcov a ochorenie pokračuje ako ľahkoreťazcový myelóm. Veľmi zriedkavo je pozorovaná prechodná zmena izotypu Ig a prítomnosť abnormálnych oligoklonových  prúžkov, ktoré sú považované  za prejav obnovy normálnej tvorby imunoglobulínov a sú spojené s lepším prežívaním.
2. Voľné ľahké reťazce v sére: Kritériá liečebnej odpovede  IMWG odporúčajú kvantitatívne stanovenie VĽR pri hodnotení liečby v prípadoch tzv. nemerateľnej choroby, t. j. oligo-  a neskeretorických foriem ochorenia, pri ktorých M-proteín  nie je merateľný inými metódami. Podmienkou  použitia VĽR v hodnotení liečebnej odpovede  je ich minimálna  bazálna koncentrácia ≥ 100 mg/l a patologický pomer. V kategórii úplnej remisie, tzv. stringent complete response sa okrem chýbania imunohistochemických  a imunofluorescenčných známok monoklonality vyžaduje aj normálny pomer VĽR v sére (tabuľka 8). Pomocou  stanovenia VĽR v sére je možné diagnostikovať tzv. „light chain escape“ fenomén, j. objavenie  sa dediferencovaného  klonu buniek produkujúcich len monoklonové VĽR, ktoré nereagujú  na liečbu.
3. Prietoková cytometria: Pri detekcii minimálnej reziduálnej choroby u liečených pacientov s mnohopočetným myelómom stanovením prítomnosti abnormálnych plazmatických buniek.
4. Monitorovanie obličkovej choroby: Poškodenie obličiek je prítomné u 20 – 50 % pacientov s myelómom. V jeho patogenéze sa uplatňuje najmä  nefrotoxicita VĽR, ktorú potenciujú  ďalšie faktory ako dehydratácia, hyperkalciémia  a nefrotoxické  liečivá. Denná produkcia  VĽR okolo 5 g je u väčšiny pacientov spojená s nefrotoxickými účinkami. Veľké množstvá prefiltrovaných VĽR prekračujú reabsorpčnú  kapacitu proximálnych tubulov, čo vedie k vzniku prerenálnej (Benceovej-Jonesovej) proteinúrie a následnému poškodeniu tubulointerstícia. Klinické prejavy varírujú od Fanconiho syndrómu cez tzv. myelómovú  obličku (cast nephropathy) až po akútne oligurické zlyhanie obličiek v dôsledku masívnej obštrukcie distálnych aj proximálnych tubulov (10). Iné typy ľahkých reťazcov pôsobia nefrotoxicky na úrovni glomerulov, pričom vyvolávajú dve rozdielne formy poškodenia – AL-amyloidózu a chorobu z ukladania ľahkých reťazcov (LCDD), ktorých hlavným klinickým prejavom je neselektívna glomerulová proteinúria nefrotického typu. Stanovenie VĽR je prínosom v diferenciálnej diagnostike vymenovaných  ochorení obličiek a pri hodnotení  účinnosti eliminačnej liečby pomocou nových hemodialyzátorov s veľkosťou pórov, ktoré dovoľujú prechod molekúl VĽR – tzv. „high cut-off dialyzer“.

Predanalytické informácie
Odber
Parametre v sére: štandardná gélová skúmavka, nie sú potrebné špeciálne podmienky pri odbere a transporte.
Imunofixácia v moči: jednorazový alebo zbieraný moč (24-hodinový zber, ak je potrebná kvantifikácia M-gradientu v moči).
Prietoková cytometria: odber periférnej krvi ako na krvný obraz.

Interferencie
Pri stanovení CB, Ig a VĽR interferuje silná hemolýza a lipémia.
Elektroforéza: vyšetrenie v plazme imituje prítomnosť M-gradientu v beta2globulínoch
(fibrinogén), hemolýza imituje M-gradient v alfa2globulínoch.

Literatúra
1. Doporučení České myelomové skupiny, Myelomové sekce České hematologické společnosti a Slovenskej myelómovej spoločnosti. Diagnostika a léčba mnohočetného myelomu. Transfuze a hematologie dnes. 2012;18(suppl1 2):1–89.
2. Bradwell AR. Serum free light chain analysis (plus Hevylite). 7th ed. Birmingham: The Binding Site Ltd.; 2014: 312.
3. Katzmann JA, Dispenzieri A, Kyle RA, et al. Elimination of need for urine studies in the screening algorithm for monoclonal gammopathies by using serum immunofixation and free light chain assay. Mayo Clinic Proceedings. 2006;81(12):1575–1578.
4. Dispenzieri A, Kyle RA, Merlini G, et al. International myeloma working group guidelines for serum free light chain analysis in multiple myeloma and related disorders. Leukemia. 2009;23:215–224.
5. Rawstron A, Orfao A Beksac M, et al. Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 2008;93(3):431–438.
6. Paiva B, Almeida J, Pérez-Andrés M, et al. Utility of flow cytometry immunophenotyping in multiple myeloma and other clonal plasma cellrelated disorders. Cytometry B Clin Cytom. 2010;78(4):239–52.
7. Rajkumar SV, Dimopoulos MA, Palumbo A, et al. International Myeloma Working Group updated criteria for diagnosis of multiple myeloma. Lancet Oncol. 2014;15:E538
8. Greipp PR. International staging system for multiple myeloma. J Clin Oncol. 2005;23(15):3412−3420.
9. Durie BG, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia 2006; 20(10):1−7.
10. Hutchinson CA, et al. Efficient removal of immunoglobulin free light chains by hemodialysis for multiple myeloma: in vitro and in vivo studies. J Am Soc Nephrol. 2007;17:886−89.
11. Lukačková R, Mladosievičová B. Riziková stratifikácia pacientov s mnohopočetným myelómom podľa prítomnosti genetických markerov. Lekársky obzor 2013;62(10):359−362.