*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper.

Úvod

Chronická  lymfocytová leukémia (CLL) je lymfoproliferatívne ochorenie charakterizované akumuláciou zrelých monoklonálnych B-lymfocytov  v periférnej krvi, kostnej dreni a  lymfatických  tkanivách.  Je najčastejšou  leukémiou dospelých západného sveta a postihuje najmä  pacientov starších  ako 50 rokov. Pri CLL bola pozorovaná značná diverzita v morfológii, imunofenotype, cytogenetike a molekulových znakoch buniek,  ktorá  vyúsťuje  do  variabilného klinického priebehu a odpovede na  liečbu. Približne jedna  tretina pacientov prežíva dlhšie ako 20 rokov po diagnostikovaní ochorenia  a nevyžaduje terapiu, u niektorých pacientov, naopak, ochorenie rapídne progreduje a je spojené s ďalšími komplikáciami(1).

Vzhľadom  na  klinickú  heterogenitu  CLL bolo  potrebné nájsť vhodné  parametre na stratifikáciu pacientov do prognostických skupín  s cieľom  uľahčiť výber vhodnej liečebnej stratégie od  „watch-and-wait“  po  alogénnu transplantáciu kmeňových buniek. V súčasnosti je určenie rizikového profilu CLL založené na identifikácii tzv. nových prognostických faktorov, medzi  ktoré  patria  aj chromozómové aberácie a mutačný  stav  génu  IGHV. Tieto  faktory  sú  nezávislé od klinického  štádia a umožňujú predikovať  prognózu ochorenia už v čase diagnózy. Znalosť genotypu CLL buniek  je základom individuálneho prístupu ku každému pacientovi a ovplyvňuje terapeutický postup(2).

Chromozómové aberácie

Napriek  relatívnej   genómovej  stabilite  CLL buniek   sa až  u 80 % pacientov vyskytujú  chromozómové aberácie(3).

Najčastejšími chromozómovými abnormalitami s prognostickým  charakterom sú  parciálne delécie 13q14, 11q22-23 a 17p13,  menej  frekventovaná je trizómia chromozómu 12. Delécia  13q14  predstavuje najčastejšiu cytogenetickú aberáciu pri CLL. Samostatná del13q14 je charakterizovaná benígnym priebehom ochorenia, v prípade kombinácie s inou aberáciou sa jej pozitívny  prognostický význam  stráca. Trizómia 12 je najčastejšou CLL aberáciou, pri ktorej dochádza k amplifikácii genetického materiálu. V niektorých prípadoch ide len o duplikáciu  segmentu medzi 12q13  a 12q21.2(4). Delécia  11q22-23 je asociovaná s horšou prognózou, pretože narúša expresiu génu ATM (ataxia teleangiectasia mutated), spôsobuje dereguláciu bunkového cyklu a vedie k akumulácii malígnych B-lymfocytov náchylných na vznik prídavných genetických aberácií. Delécia 17p13  je asociovaná s veľmi agresívnym priebehom ochorenia a so slabou odpoveďou na terapiu v dôsledku deregulácie expresie TP53(3). Prítomnosť aberácií TP53 zaraďuje pacienta do „ultra high-risk“ CLL skupiny. Zriedka sa vyskytuje samostatne, zvyčajne je asociovaná s ďalšími aberáciami(5).

Somatické mutácie  IGHV

Nezávislým prognosticky významným markerom CLL je stanovenie mutačného statusu IGHV, ktorý kóduje variabilnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínov. V roku 1999 Damle a kolektív uverejnili publikáciu, kde vysvetľujú heterogenitu, ktorá bola v praxi pozorovaná u pacientov s CLL. Podľa mutačného stavu  IGHV rozdelili pacientov na dve skupiny. Pacienti s rozdielom v nukleotidovej sekvencii oproti  zárodočnej línii > 2 %, t. j. mutovaným stavom IGHV génu (M-IGHV), sú charakteristickí miernejším priebehom ochorenia. Tento stav je považovaný za prognosticky priaznivý a definuje  potenciálne  indolentnú formu  CLL. U pacientov s rozdielom oproti zárodočnej línii ≤ 2 %, t. j. nemutovaným stavom IGHV génu (UM-IGHV), tento stav koreluje  s horšou prognózou a kratším prežívaním. Pacienti  s UM-IGHV sú náchylní  na  vývin cytogenetických abnormalít alebo  na tzv. Richterovu  trans- formáciu (transformácia CLL na  vyšší stupeň malignity)(6). Okrem rozdielov v dĺžke prežívania boli medzi týmito dvoma skupinami pacientov pozorované rozdiely v prítomnosti nepriaznivých  cytogenetických abnormalít. Nepriaznivé aberácie (del11q22-23, del17p13) sa objavujú  častejšie u pacientov s UM-IGHV, priaznivá aberácia (samostatná del13q14) je častejšie asociovaná s M-IGHV(7). Táto nevyvážená distribúcia  len zdôrazňuje rozdielne biologické pozadie CLL podskupín  s mutovaným a nemutovaným IGHV, ale len čiastočne vysvetľuje ich rozdielny klinický priebeh(8).

Materiál a metodika

Súbor pacientov

Za obdobie 8/2015 – 2/2016 sme vyšetrili 200 pacientov s podozrením na  CLL. Súbor  pacientov pozostával zo 109 mužov a z 91 žien. Pacienti boli v čase diagnózy vo veku 34 – 89 rokov. Na molekulovú analýzu sme používali periférnu krv alebo  kostnú dreň, ktoré boli odobraté do skúmaviek s EDTA a zároveň do skúmaviek TEMPUS. Vzorky DNA na analýzu MLPA boli izolované kitom Magnesia 16 Genomic  DNA Whole Blood Kit (Anatolia Geneworks). Vzorky RNA na analýzu IGHV mutačného statusu boli izolované pomocou kitu Tempus Spin RNA Isolation Kit (ThermoFisher Scientific).

IGH Somatic Hypermutation Assay

Princípom metódy je fragmentová analýza,  pomocou ktorej sme identifikovali  prestavby génu  IGH (gén pre ťažký reťazec imunoglobulínu), a Sangerovo sekvenovanie, ktorým sme zisťovali mutačný status génu IGHV. Používali sme IGH Somatic Hypermutation Assay  v2.0 – Gel Detection kit (Invivoscribe),  IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – ABI Fluorescence Detection kit (Invivoscribe) a BigDye Termina- tor v3.1 Cycle Sequencing Kit (ThermoFisher Scientific). PCR produkty boli separované pomocou genetického analyzátora ABI 3500 Series  Genetic Analyzer (ThermoFisher Scientific). Fragmentovú analýzu sme vyhodnotili v softvéri GeneMapper Software 5 (ThermoFisher Scientific),  na hodnotenie sekvenovania sme použili softvér Sequencing Analysis  Software v6.0 (ThermoFisher Scientific). Po  analýze sme sekvencie vzoriek porovnali so sekvenciami IGHV génu zárodočnej línie B-lymfocytov pomocou databázy IMGT/V-QUEST.

MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)

Chromozómové aberácie sme detegovali u pacientov metódou MLPA, ktorej  princípom je hybridizácia špecifických prób na cieľové sekvencie DNA. Používali sme kit SALSA ML- PA P040  CLL probemix kit (MRC-Holland) obsahujúci sondy pre niekoľko chromozómových oblastí,  ktoré  majú  u pacientov s CLL diagnosticky alebo  prognosticky významnú úlohu:

11q22-23, chromozóm 12, 13q a 17p.  PCR produkty  boli separované pomocou genetického analyzátora ABI 3500 Series Genetic  Analyzer (ThermoFisher Scientific), výsledky sme vyhodnotili v softvéri  Coffalyser. Net Software (MRC-Holland).

Štatistická analýza

Na vyhodnotenie frekvencií mutačného statusu IGHV a interpretáciu vzťahu medzi výskytom chromozómových aberácií a mutačným stavom IGHV sme použili χ² test.

Výsledky

Stanovenie IGHV segmentu a mutačného statusu

Metódou fragmentovej analýzy  sme v celom  súbore pacientov stanovili klonalitu  populácie B-lymfocytov. U 150 (75 %) pacientov sme preukázali monoklonálnu populáciu typickú pre  CLL (obrázok 1 (A)), u zvyšných  50 (25 %) pacientov sme detegovali rôzne  typy iných populácií  (obrázok 1 (B)). Po stanovení klonality sme do ďalšieho skríningu  zaradili 154 (77 %) pacientov, u ktorých bolo možné určiť IGHV segment a jeho mutačný status. Najčastejšie sa vyskytujúcim segmentom v súbore pacientov bol IGHV1-69 prítomný u 22 (14,29 %) pacientov, a to výhradne  v nemutovanom stave. Druhým najčastejšie sa vyskytujúcim  segmentom bol IG– HV3-30 u 18 (11,69 %) pacientov. Všetky ostatné segmenty mali v súbore zastúpenie menej  ako 10 %. Z týchto  mali najvyššiu frekvenciu segmenty IGHV3-21, IGHV3-7 a IGHV4-34, ktoré boli vo väčšine prípadov mutované. U jedného pacienta s biklonálnou populáciou B-lymfocytov bolo možné stanoviť výsledok  pre oba klony: segment IGHV1-69 v nemutovanom stave a segment IGHV4-59 v mutovanom stave.

Detekcia chromozómových aberácií

U pacientov sa chromozómové aberácie vyskytovali samostatne aj v rôznych kombináciách. U 79 (39,5 %) pacientov sme nedetegovali  žiadnu  aberáciu. Najväčšiu frekvenciu výskytu sme zaznamenali pri del13q14, a to celkovo u 85 (42,5 %) pacientov.  Delécia  sa najčastejšie vyskytovala samostatne, a to v 58 (68,24 %) prípadoch. Druhou najfrekventovanejšou aberáciou bola del11q22-23, ktorú sme detegovali u 27 (13,5 %) pacientov. Parciálnu trizómiu  12 (obrázok  2) sme zaznamenali u 23 (11,5 %) pacientov. Najmenej početnou zo sledovaných aberácií bola del17p13 detegovaná u 10 (5 %) pacientov. V 3 (1,5 %) prípadoch sme pozorovali prítomnosť 3 aberácií súčasne. U 7 (3,5 %) pacientov bol výsledok neinformatívny.

Diskusia

Klinický obraz  CLL vyznačujúci sa stabilným priebehom ochorenia  bez  potreby liečebnej  intervencie alebo,  naopak, s vysokou  početnosťou  relapsov vyžadujúcich opakovanú terapiu je preukázateľne ovplyvnený  výskytom  genetických zmien v bunkách CLL. Hoci žiadna konkrétna genetická abnormalita nebola identifikovaná ako príčina  vzniku CLL, ochorenie je charakteristické prítomnosťou molekulovogenetických markerov, na základe ktorých je možná stratifikácia pacientov do prognostických skupín a individuálny terapeutický prístup.

Polyklonalita populácie  B-lymfocytov  u zdravého jedinca  je dôsledkom rôznorodej dĺžky preskupených génov IGHV. U pacienta s CLL je táto  rôznorodosť z veľkej časti narušená, preto  je pre CLL typická monoklonálna populácia, pri ktorej jeden klon úplne potlačil ostatné klony. Prítomnosť takejto populácie sme dokázali u 75 % pacientov. Polyklonálnu populáciu sme identifikovali  u 16 % pacientov, u ktorých nebolo  možné potvrdiť diagnózu CLL. V takýchto prípadoch je nutné  kritické posúdenie nálezu  a s odstupom času realizovať  dodatočné vyšetrenia na  stanovenie definitívnej diagnózy. U 3 % pacientov sme dokázali polyklonálnu populáciu, v ktorej mal jeden klon výrazné zastúpenie, a u jedného pacienta sme zistili dva prevažujúce klony. Prítomnosť polyklonálnej  populácie, v ktorej pôvodne minoritný klon získal rastovú výhodu, sme považovali za znak subklonálnej selekcie. U takýchto pacientov je dôležitá stratégia „watch-and-wait“, teda  pacienta dôkladne sledovať a časom vyšetrenia zopakovať na detekciu progresu ochorenia.

U 5 % pacientov sme detegovali biklonálnu  populáciu. Takéto prípady sú zriedkavé a nie veľmi dobre charakterizované. Bolo navrhnutých niekoľko príčin, kedy u pacienta s CLL môže byť detegovateľná viac ako jedna IGH prestavba. Bunky CLL môžu  exprimovať  dva rôzne  receptory BCR (B cell receptor), a teda sekretovať dva typy protilátok. Takéto  bunky označujeme ako dvojnásobne produktívne (HCDP, heavy chain  double productive)(9). Druhou z možností je, že pacienti majú dve IGH prestavby detegovateľné pomocou PCR, ale iba jedna  je produktívna  a translatovaná do imunoglobulínu(10). Ďalším možným vysvetlením biklonálneho modelu je, že v krvi pacienta sú naozaj prítomné dva malígne klony so samostatným pôvodom, pričom  každý exprimuje  iný imunoglobulín. V tomto prípade ide o pravú biklonálnu  leukémiu(11). Vysoký výskyt atypických  modelov poukázal na dôležitosť vyšetrenia klonality nádorovej populácie u CLL suspektných pacientov.

Somatické mutácie génu  IGHV sú prítomné asi v polovici prípadov  CLL(8). Nemutované CLL bunky pravdepodobne pochádzajú z B-lymfocytov, ktoré podstúpili antigénovú stimuláciu až po malígnej transformácii. Zachovávajú si reaktivitu na antigén, dôsledkom čoho  je ich vysoká proliferačná aktivita. Naopak,  mutované bunky CLL prešli malígnou transformáciou až  po stimulácii antigénom, nemajú zachovanú signálnu kapacitu BCR receptora a prognóza je priaznivejšia (12). IGHV segment a mutačný status bolo možné určiť u 77 % pacientov. U jedného pacienta s biklonálnou populáciou bolo možné stanoviť  dva výsledky, celkovo  sme teda  analyzovali 154 pacientov, ale 155 segmentov (graf 1). Až 52,26 % segmentov nevykazovalo somatickú hypermutáciu, 47,74 % segmentov bolo v mutovanom stave. V porovnaní so svetovými štúdiami bola frekvencia mutovaných a nemutovaných IGHV génov rovnaká ako v populácii  Spojených štátov (53 % UM-IGHV, 47 % M-IGHV)(13). Celkovo sme zaznamenali 29 ty- pov segmentov, pričom až 14 typov patrilo do génovej rodiny IGHV3. Z celkového počtu  155 identifikovaných génov  tvorili segmenty tejto génovej  rodiny až 52,26 % prípadov.  IGHV3 je vo všeobecnosti najrozšírenejšou génovou rodinou, čo potvrdzujú viaceré  európske i svetové štúdie.

Najčastejšie  sa  vyskytujúcim segmentom  v súbore bol IGHV1-69 prítomný  u 14,29 % pacientov a vyskytoval  sa výhradne v nemutovanom stave. Veľmi podobná frekvencia bola  reportovaná v populácii Švédska, kde  bol  tento segment tiež  najfrekventovanejší a rovnako  sa vyskytoval  výhradne v nemutovanom stave(14). Druhým najčastejším génom bol IGHV3-30 zaznamenaný u 11,69 % pacientov, z toho u 61,11 % prípadov  mutovaný. Segment bol tiež často reportovaný v oblasti Stredozemného mora(15). IGHV3-30 je vo väčšine oblastí asociovaný s mutovaným stavom. Prítomnosť segmentu IGHV3-21 sme stanovili  u 7,79 % prípadov. Preferenčne sa vyskytoval  mutovaný, a to u 58,33  % pacientov. IGHV3-21 je asociovaný s horšou prognózou bez ohľadu  na mutačný status(16).  Najvyššia prevalencia génu bola publikovaná  v Škandinávii  (11,2  %), kde  sa vyskytoval prevažne v mutovanom stave(14). Naopak,  v populáciách južnej Európy (Francúzsko, Grécko, Taliansko, Španielsko) je výskyt IGHV3-21 značne nižší (2,9 %) a nižšia  je aj prítomnosť somatickej hypermutácie(15). Rozdiely vo výskyte jednotlivých génov  IGHV pravdepodobne reflektujú  nielen variácie  v genetickom pozadí CLL, ale  aj leukemickú variabilitu dependentnú od geografickej polohy(17). Tieto rozdiely  tiež  môžu znamenať, že prestavby IGH génu kódujú špecifický epitop, na ktorý sa viaže  neznámy antigén a stimuluje proliferáciu B-lymfocytov(14).

Napriek  relatívnej  genómovej stabilite buniek  CLL sa až u 80 % pacientov vyskytujú  chromozómové aberácie. Vo všeobecnosti majú  pacienti s del17p13 a del11q22-23 horšiu prognózu a kratšie prežívanie, pretože narúšajú expresiu tumor-supresorových génov TP53 a ATM. Prítomnosť del13q14 má pri samostatnom výskyte priaznivý prognostický charakter a prognostický význam  trizómie  12 je sporný(3). Prítomnosť aberácií sme dokázali u 57 % pacientov. U 39,5 % pacientov sme nedetegovali žiadnu abnormalitu a v 3,5 % prípadov  nebolo  možné výsledky vyhodnotiť. Ak by sme vyhodnotili len 168 pacientov, u ktorých sme potvrdili plne vyvinutú CLL (prípady  s monoklonálnou populáciou) alebo vyvíjajúcu sa CLL (prípady  s atypickým  modelom populácie), prítomnosť  aberácie by sme detegovali u 64,88  % pacientov. Dané  výsledky  neboli  v súlade s publikovanými údajmi iných štúdií, ale boli značne nižšie. Nemecké štúdie uvádzajú frekvenciu  chromozómových abnormalít 82 – 85,2 %(3,18), frekvencia  vo Veľkej Británii je 69 %(19)  a v USA 72,5 %(20). Uvedený rozdiel mohol  byť ovplyvnený viacerými faktormi, napr. kompozíciou a veľkosťou súboru, rozdielmi v indikačných kritériách či metodickými rozdielmi.

U 12,5 % pacientov sme neidentifikovali žiadnu  aberáciu a súčasne sme pozorovali polyklonálny model populácie. Takíto pacienti nevykazujú žiadne základné molekulovogenetické  znaky  rozvíjajúceho sa ochorenia CLL. Normálny  karyotyp sme pozorovali aj v 24 % prípadov  s monoklonálnou populáciou, čo je priaznivý prognostický znak.  U pacientov s atypickým  modelom populácie (polyklonálna s jedným alebo dvoma prevažujúcimi klonmi, biklonálna, triklonálna,) sme nezaznamenali asociáciu so žiadnou špecifickou aberáciou.

Najväčšiu frekvenciu výskytu sme zaznamenali pri del13q14, a to celkovo  u 42,5  % pacientov. Delécia  sa najčastejšie vyskytovala samostatne, a to u 68,24  % pacientov. Prevalencia a samostatný výskyt boli najviac  podobné stavu v USA (62 %)(20). Pre pacientov predstavuje samostatný výskyt tejto  aberácie priaznivú  prognózu. U 31,76  % pacientov bola pozorovaná spolu s niektorou ďalšou aberáciou a jej priaznivý prognostický význam sa strácal. Del13q14 bola jedinou aberáciou, ktorú sme dokázali u pacientov s polyklonalitou B-lymfocytov. Vysvetlením  tohto  faktu môže  byť, že delécia postihuje gény MIR15A a MIR161 kódujúce miRNA, ktorých úlohou je negatívna regulácia génu BCL2 (B cell lymphoma 2) na posttranskripčnej úrovni. Pri delécii týchto génov dochádza k zvýšenej expresii  antiapoptotického proteínu Bcl2, čo môže spôsobovať perzistentnú lymfocytózu aj u pacientov s polyklonálnou populáciou. Druhou najfrekventovanejšou aberáciou bola del11q22-23, ktorú  sme detegovali u 13,5 % pacientov. Prevalencia delécie bola podobná Nemecku (12 %)(18). Bunky CLL s del11q22-23 sú  náchylnejšie na vznik ďalších genetických aberácií(5). Prítomnosť parciálnej trizómie  12 sme zaznamenali u 11,5 % pacientov a jej výskyt bol v súlade s frekvenciou u nemeckých pacientov (13,6 %)(18). Trizómia 12 je považovaná za marker s intermediárnou prognostickou hodnotou(3). Najmenej  početná zo sledovaných aberácií bola  del17p13, detegovaná u 5 % pacientov. Výskyt delécie sa zhoduje s britskou  (6 %)(19)  a nemeckou populáciou (7 %)(18). Bez ohľadu na prítomnosť inej aberácie je asociovaná s veľmi agresívnym priebehom ochorenia, pretože narúša expresiu génu  TP53(3). U 1,5 % pacientov sme zaznamenali prítomnosť 3 aberácií súčasne, čo je indikátorom agresívneho priebehu ochorenia. Nižšiu frekvenciu chromozómových abnormalít v porovnaní so zahraničnými štúdiami pripisujeme ich zachyteniu v raných štádiách ochorenia. Neprítomnosť aberácie sa však môže  časom  zmeniť v dôsledku klonálnej evolúcie buniek CLL.

V súbore pacientov sme tiež sledovali vzájomný vzťah mutačného statusu IGHV s výskytom chromozómových aberácií (graf 2). Zo 79 pacientov negatívnych na chromozómové aberácie sme v 32,91 % prípadov  stanovili nemutovaný stav IGHV, u 27,85 % pacientov stav mutovaný. U 39,24 % negatívnych  pacientov s polyklonálnou, biklonálnou a triklonálnou populáciou sme mutačný status neurčovali. Vzhľadom  na rovnomerné percentuálne zastúpenie  jednotlivých kategórií sme neidentifikovali žiaden preferenčný mutačný status. Del13q14  bola  prevažne, t. j. u 51,76  % prípadov, asociovaná s M-IGHV. U týchto  pacientov bola  jedinou  detegovanou aberáciou, čo potvrdzuje jej priaznivý prognostický význam. U 34,12 % pacientov sa vyskytovala v spojení s UM-IGHV, pričom bola u nich okrem del13q14 pozorovaná ešte aspoň jedna aberácia. Vzťah chromozómových aberácií s mutačným statusom potvrdil koreláciu prognosticky priaznivej aberácie, samostatnej del13q14, s mutovaným stavom IGHV. Trizómiu 12 sme pozorovali v asociácii s UM-IGHV u 52,17 % pacientov, v 34,79  % prípadov bola  asociovaná s M-IGHV. Preferenčný  status však  nebolo možné určiť, pretože rozdiel  vo frekvenciách nebol preukazný (P = 0,0706), čo naznačuje intermediárnu prognostickú hodnotu. Del11q22-23 sa vyskytovala výhradne u pacientov s UM-IGHV a nikdy sa nevyskytovala u pacientov s typickou polyklonalitou. Dosiahnuté výsledky potvrdili negatívny prognostický význam  del11q22-23. Deléciu 17p13  s najmenej priaznivou prognózou sme v 70 % prípadov pozorovali s UM-IGHV, čo potvrdzuje ich koreláciu. Mutačný status tiež súvisel  s počtom chromozómových abnormalít.  U 28 pacientov sme detegovali prítomnosť dvoch a viacerých aberácií,  z toho 67,88 % prípadov  bolo asociovaných s nepriaznivým nemutovaným stavom IGHV. Pozorovaný vzťah chromozómových aberácií s mutačným statusom potvrdil prognostickú koreláciu a výsledky boli v súlade so štúdiami z Nemecka(18) či Veľkej Británie(19).

Záver

V súčasnosti je hlavným vedeckým cieľom analýzy prognostických markerov nájsť genetické vysvetlenie klinickej heterogenity CLL. Molekulovogenetické parametre, ako je mutačný  status IGHV a chromozómové aberácie, boli úspešne zavedené do klinickej praxe.  V predloženej štúdii sme preukázali, že stav týchto parametrov v slovenskej populácii je intermediárny,  pretože so  žiadnou zo zahraničných štúdií sa nezhodoval úplne. Naznačuje to nielen genetické pozadie ochorenia, ale  aj existenciu environmentálneho antigénového tlaku  na  selekciu  B-lymfocytov.  Výsledkom  správnej detekcie a interpretácie prognostických faktorov je skorá stratifikácia pacientov do prognostických skupín  pre voľbu vhodnej terapeutickej stratégie a následné zlepšenie klinickej starostlivosti.

Poďakovanie

Moja vďaka patrí všetkým kolegom, ktorí sa podieľali na príprave a vyhodnocovaní vzoriek pacientov vyšetrovaného súboru.

Literatúra
1. Rodríguez D, Bretones G, Arango JR., et al. Molecular pathogenesis ofCLL and its evolution. International Journal of Hematology 2015; 101(3): 219-228.
2. Balhárek T, Barthová M, Szépe P, et al. Komentár k vývoju konceptu prognostických faktorov chronickej lymfocytovej leukémie: Cesta od prognostických faktorov k prediktorom liečebnej odpovede. Klinická Onkologie
2009; 22(6): 254-263.
3. Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine 2000; 343(26): 1910-1916.
4. Cuneo A, Cavazzini F, Ciccone M, et al. Molecular cytogenetic lesions in chronic lymphocytic leukemia. Hematology Meeting Reports 2009; 3(3): 86-90.
5. Copáková L, Piačková B, Leitnerová M. Význam delécie a mutácie génu TP53 a ďalších prognostických markerov u pacientov s CLL. Onkológia 2014; 9(2): 100-103.
6. Damle RN, Wasil T, Fais F, et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94(6): 1840-1847.
7. Kröber A, Seiler T, Benner A, et al. V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002; 100(4): 1410-1416.
8. Rodríguez-Vicente AE, Díaz MG, Hernández-Rivas JM. Chronic lymphocytic leukemia: a clinical and molecular heterogenous disease. Cancer Genetics 2013; 206(3): 49-62.
9. Kalmanovich G, Mehr R. Models for antigen receptor gene rearrangement. iii. heavy and light chain allelic exclusion. The Journal of Immunology 2003; 170(1): 182-193.
10. Buc M. Imunológia. Bratislava: Veda 2001; 463 pp.
11. Chang H, Cerny J. Molecular characterization of chronic lymphocytic leukemia with two distinct cell populations: Evidence for separate clonal origins. American Journal of Clinical Pathology 2006; 126(1): 23-28.
12. Stevenson FK, Krysov S, Davies AJ, et al. B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2011; 118(16): 4313-4320.
13. Rassenti LZ, Huynh L, Toy TL, et al. ZAP-70 compared with immunoglobulin heavy-chain gene mutation status as a predictor of disease progression in chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine 2004; 351(9): 893-901.
14. Tobin G, Thunberg U, Johnson A, et al. Somatically mutated IgVH3-21 genes characterize a new subset of chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002; 99(6): 2262-2264.
15. Ghia P, Stamatopoulos K, Belessi C, et al. Geographic patterns and pathogenetic implications of IGHV gene usage in chronic lymphocytic leukemia: the lesson of the IGHV3-21 gene. Blood 2005; 105(4): 1678-1685.
16. Dal-Bo M, Del Giudice I, Bomben R, et al. B-cell receptor, clinical course and prognosis in chronic lymphocytic leukaemia: the growing saga of the IGHV3 subgroup gene usage. British Journal of Haematology 2011;
153(1): 3-14.
17. René C, Prat N, Thuizat A, et al. Comprehensive characterization of immunoglobulin gene rearrangements in patients with chronic lymphocytic leukaemia.
Journal of Cellular and Molecular Medicine 2014; 18(6): 979-990.
18. Haferlach C, Dicker F, Schnittger S, et al. Comprehensive genetic characterization of CLL: a study on 506 cases analysed with chromosome banding analysis, interphase FISH, IgVH status and immunophenotyping. Leukemia 2007; 21(12): 2442-2451.
19. Oscier DG, Gardiner AC, Mould SJ, et al. Multivariate analysis of prognostic factors in CLL: clinical stage, IGVH gene mutational status, and loss or mutation of the p53 gene are independent prognostic factors. Blood 2002; 100(4): 1177-84.
20. Nelson BP, Gupta R, Dewald GW, et al. Chronic lymphocytic leukemia FISH panel: impact on diagnosis. American Journal of Clinical Pathology 2007; 128(2): 323-332.