*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf attachment at the end of the paper.

Úvod
Myelodysplastický syndróm (MDS) predstavuje heterogénnu skupinu chronických myeloidných ochorení s pôvodom v kostnej dreni. Ide o klonálnu poruchu krvotvorby ako dôsledok mutácií vznikajúcich v pluripotentných kmeňových bunkách. Vplyvom mutácií dochádza k nedostatočnej maturácii, diferenciácii, resp. porušenej proliferácii, a k morfologickej dysplázii krvných elementov. Tieto zmeny vedú k vzniku inefektívnej dysplastickej hematopoézy s potenciálnym rizikom transformácie MDS do akútnej myeloblastovej leukémie (AML) až v 30 % všetkých prípadov. Spoločným znakom ochorenia je hypercelulárna kostná dreň a prítomnosť rôzneho stupňa periférnej cytopénie. Typická je prítomnosť anémie, ale aj leukopénie a trombocytopénie a ich vzájomná kombinácia(1). MDS patrí medzi časté hematologické malignity v Európe s celkovým výskytom približne 4 prípady na 100 000 obyvateľov za rok. Výskyt prudko stúpa so zvyšujúcim sa vekom najmä vo vekovej skupine nad 60 rokov a vo veku ≥ 80 rokov je incidencia ochorenia až 50 prípadov/100 000 obyvateľov ročne. Medián veku pri nástupe choroby je okolo 70 rokov, pričom z celkového počtu pacientov len 10 % tvoria pacienti s vekom pod 50 rokov(2). Deti sú postihnuté zriedkavo, priebeh ochorenia a cytogenetické nálezy sú odlišné od dospelých pacientov(3).

Príčiny vzniku MDS

Vývoj MDS je viacstupňový proces, pri ktorom dochádza k zmenám v genetickom materiáli pluripotentnej hematopo- etickej kmeňovej bunky. Tá je morfologicky a funkčne odlišná a získava rastovú výhodu. Mechanizmus patogenézy MDS nie je v súčasnosti úplne objasnený, predpokladá sa postihnutie génov regulujúcich rast, diferenciáciu a zánik bunky. Takto pozmenená bunka proliferuje a postupne jej klony nahrádzajú zdravé kmeňové bunky, čím nastáva útlm alebo zastavenie normálnej krvotvorby(4). Rozoznávame dva typy MDS – primárny a sekundárny. O primárnom hovoríme, keď nie je známa príčina ochorenia. Predstavuje 85 % zo všetkých MDS a postihuje hlavne staršiu populáciu s priemerným vekom 60-70 rokov. V posledných rokoch stúpa incidencia primárneho MDS, a to vzhľadom na lepšie diagnostické metódy, starnutie populácie a pôsobenie faktorov prostredia(5). Pri sekundárnom MDS (~ 15 %) vieme objasniť príčiny vzniku ochorenia. Môže ich byť viacero, napríklad chemoterapia, rádioterapia alebo vplyv environmentálnych toxínov(6).

Prognóza ochorenia

Priebeh ochorenia je veľmi variabilný, od najľahších foriem s priemerným prežívaním niekoľko rokov až po najťažšie formy s prežívaním nižším ako 5 mesiacov(7). Z hľadiska prognózy existuje niekoľko prognostických systémov, ktoré na základe súvisiacich znakov triedia pacientov do rizikových kategórií(8). V súčasnosti sa používa Revidovaný medzinárodný prognostický skórovací systém – IPSS-R, ktorý delí pacientov do 5 rizikových kategórií v súlade s konkrétnymi parametrami  udávajúcimi  prognostický  význam a podľa ktorých prebieha liečba. IPSS-R zahŕňa aj MDS Cytogenetický skórovací systém (tabuľka 1), ktorý určuje prognostickú skupinu pacienta na základe cytogenetických nálezov v karyotype(9).

Chromozómové aberácie

Chromozómové aberácie zohrávajú dôležitú úlohu v patogenéze, prognóze a diagnostike ochorenia. Pri primárnom MDS sa zaznamenali pri 40 – 60 % pacientoch. Pacienti so sekundárnym MDS majú spravidla viac zmien v genotype, až v 80 – 90 % sú pozorované chromozómové prestavby (6). Komplexný karyotyp s viac ako tromi aberáciami naraz je pozorovaný približne u 15 % de novo MDS oproti 50 % pri sekundárnom MDS(10).

Medzi najčastejšie zmeny patria del(5q)/–5, 01507/ del(7q), +8, del(20q) a –Y. Menej často sa vyskytuje –17/ del(17p)/i(17q), –18/del(18q), +21, +19, inv/t/del(3q), –13/ del(13q), –21, t(5q), +11, +1/+1q, del(12p), del(11q), t(7q), +mar a iné(7,11).

Podľa prítomných zmien v bunkách môžeme predpokladať prognózu ochorenia. U pacientov s dobrou prognózou nachádzame normálny karyotyp, prípadne len jednoduché zmeny. Priebeh ochorenia je mierny, dlhotrvajúci s prežívaním niekoľko rokov a liečba je väčšinou symptomatická. Čím je prognóza horšia, tým je kratší čas prežívania pacientov, sú prítomné rôzne genetické zmeny a je väčšia aj pravdepodobnosť leukemickej transformácie(12).

Spôsoby detekcie genetických zmien

1.  Cytogenetická analýza

K základným metódam na detekciu aberácií patrí cytogenetická analýza chromozómov. Umožňuje sledovať numerické a štruktúrované prestavby karyotypu. Veľkou výhodou metódy je možnosť vyšetriť všetky chromozómy v jednom pohľade. Nevýhodou je neschopnosť identifikovať submikroskopické zmeny pod detekčným limitom metódy a zároveň potreba metafáz.

2.  FISH metóda

Fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) je bežnou metódou v cytogenetických laboratóriách a k jej výhodám patrí možnosť analýzy buniek nielen v metafáze, ale aj v interfáze, keď nie je nutná kultivácia buniek. Ďalšou výhodou je rýchle analyzovanie veľkého množstva buniek. Zároveň umožňuje odhaliť aberácie aj asi v 15 % cytogeneticky negatívnych prípadov a pomáha objasňovať komplexné prestavby. Limitujúcim faktorom metódy je možnosť identifikácie len tých úsekov DNA, pri ktorých sú použité sondy. Na relevantnú detekciu treba mať vo vzorke aspoň 1 – 5 % aberantných interfázových jadier.

Tabuľka 1. MDS Cytogenetický skórovací systém(9, upravené)

3.  MLPA analýza

Podobne ako FISH aj molekulárno-cytogenetická metóda MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) využíva naviazanie oligonukleotidových sond na cieľovú sekvenciu DNA na základe ich komplementarity. Oproti FISH je táto metóda schopná identifikovať naraz viac ako 40 rôznych sekvencií DNA v jednej reakcii(13). Sondy využívané pri MLPA metóde majú kratšiu dĺžku (50 – 70 bp) a umožňujú citlivú detekciu aj iných klinicky relevantných MDS abnormalít s nižšou frekvenciou. Výhodou MLPA je odlíšenie sekvencií, ktoré sa navzájom líšia rozdielom jedného nukleotidu. Nevýhodou techniky je potreba mať vo vzorke aspoň 30 % mutovaných buniek na spoľahlivú detekciu abnormalít(14).

Cieľom našej práce bolo:

1. Vytvoriť a analyzovať súbor pacientov s diagnózou MDS vyšetrených na našom oddelení genetiky v čase od februára 2016 do apríla
2. Zistiť prítomnosť chromozómových aberácií, charakterizovať ich, určiť ich incidenciu v súbore a rozdeliť pacientov podľa prítomných aberácií.
3. Zhodnotiť vzťah medzi výsledkami vyšetrení a prognózou.
4. Stanoviť prínos jednotlivých metód pri hodnotení chromozómových aberácií a porovnanie úspešnosti použitých metód – klasická cytogenetika, metóda FISH a metóda

Súbor pacientov a metódy

Do práce sme zaradili pacientov s diagnózou MDS, ktorí boli vyšetrovaní v našom laboratóriu genetiky od februára 2016 do apríla 2018. Kritériom na zaradenie pacienta bola diagnóza stanovená lekárom na žiadanke. Celkovo sme analyzovali 620 vzoriek pacientov, z toho 383 vzoriek kostnej drene (KD) a 237 vzoriek periférnej krvi (PK). V práci sme použili nasledovné metódy: cytogenetika, FISH a MLPA.

Preparáty na vyšetrenie karyotypu boli pripravené 24-hodinovou kultiváciou buniek KD v kompletnom médiu a spracované podľa štandardných postupov. U 360 pacientov bolo analyzovaných, ak to bolo možné, 20 metafáz a bol stanovený cytogenetický zápis podľa ISCN (International System of Chromosome Nomenclature). Pri metóde FISH sa ako vstupný materiál použila kultivovaná KD a/alebo PK pacienta pripravená priamym spracovaním. Následne prebehla hybridizácia s príslušnou sondou a hodnotenie preparátov pod fluorescenčným mikroskopom. Spolu bolo zhodnotených 521 vzoriek, 380 KD a 141 PK. Vstupným materiálom na analýzu MLPA bola izolovaná DNA zo vzorky KD a/alebo PK dodaná v EDTA. Na analýzy sa použil kit SALSA MLPA P414-B1 MDS probemix (MRC – Holland) na detekciu 46 špecifických chromozómových oblastí s amplifikačnými produktmi od 122 do 469 nukleotidov. Sondy sú navrhnuté na naj- rozšírenejšie a na prognosticky relevantné aberácie pri MDS podľa IPSS-R. Toto metódou sa vyšetrilo 398 pacientov (214 KD a 184 PK).

Výsledky

1.  Charakteristika a analýza súboru pacientov

Súbor zahŕňa vzorky kostnej drene alebo periférnej krvi od 620 pacientov a pozostáva z 289 (46,6 %) pacientov mužského a 331 (53,4 %) ženského pohlavia. Vekový medián pacientov v čase určenia diagnózy bol 69 rokov s vekovým rozpätím 13 až 93 rokov. Pacienti vyšetrení zo vzorky kostnej drene mali patológie v 36 % prípadoch, pacienti vyšetrení zo vzorky periférnej krvi len v 14 % prípadoch.

1.  Incidencia chromozómových abnormalít

Z výsledkov vzoriek kostnej drene 383 pacientov, ktorí boli vyšetrení cytogeneticky, metódou FISH a/alebo MLPA, sme charakterizovali a následne stanovili výskyt najčastejších abnormalít. Detegovali sme spolu 287 chromozómových aberácií, pričom u 99 % pacientov boli použité aspoň dve metódy na vyšetrenie. Na grafe je znázornené jednotlivé zastúpenie aberácií ako izolované abnormality v genóme a ako abnormality, ktoré sa vyskytli v kombinácii s inými patológiami.

2.  Určenie prognózy pacientov

Pomocou výsledkov vyšetrení z analýz vzoriek kostnej drene získaných metódami cytogenetiky, FISH a/alebo MLPA bola stanovená prognóza a medián prežívania 383 pacientom. Hodnotené bolo zastúpenie jednotlivých pacientov v prognostických skupinách a ich celkové prežívanie.

Medián prežívania sme vypočítali štatistickou Kaplanovou-Meierovou metódou spoločne pre 351 pacientov, od ktorých sme mali dostupné informácie o prežívaní, resp. úmrtí. Úspešne sme stanovili medián v skupinách: stredná, zlá a veľmi zlá. V skupinách veľmi dobrá a dobrá mali pacienti vyššie prežívanie a pri ich prognózach neklesla pravdepodobnosť prežitia pod 0,5 (50 %). Nezískali sme teda relevantné dáta, keďže veľká časť pacientov ešte stále žije. Grafické zobrazenie demonštruje, že s horšou prognózou klesá aj prežívanie pacientov. V tabuľke 3 je zhrnutie údajov z jednotlivých rizikových skupín. Zobrazené sú počty pacientov v skupinách, počet úmrtí a žijúcich v danej skupine a percento prežívania skupiny.

3.  Stanovenie úspešnosti použitých metód

Všetkými troma metódami súčasne bolo vyšetrených 80 pacientov. Tento súbor slúžil na porovnanie úspešnosti použitých metód. Porovnávali sme počet úspešných analýz jednotlivých metód, ktoré potvrdili aspoň jednu chroanalýzach. Ukázala sa ako najcitlivejšia metóda na odhalenie prítomnosti aberácií. Analýza karyotypu bola pozitívna pri 60 (75 %) prípadoch. Skríningová metóda MLPA preukázala porovnateľnú úspešnosť ako cytogenetická analýza. Zaznamenala pozitívny nález u 59 (74 %) pacientov.

Diskusia

MDS je ochorenie prevažne starších ľudí s mediánom 70 rokov v čase diagnózy, skupinu pod 50 rokov tvorí ~ 10 % pacientov(2). V našej práci bol vekový medián 69 rokov a počet pacientov mladších ako 50 rokov bol 15 %. Incidencia MDS rapídne stúpa s vekom nad 60 rokov. Greenberg a kol.(9) uvádzajú, že až 77 % pacientov je v čase určenia diagnózy starších ako 60 rokov. V našej práci tvorili pacienti s vekom nad 60 rokov podiel 74 %.

Na štandardné analýzy bolo použitých 383 vzoriek kostnej drene a 237 vzoriek periférnej krvi. Pacienti vyšetrení zo vzorky kostnej drene mali patológie v 138 (36 %) prípadoch, pacienti vyšetrení zo vzorky periférnej krvi len v 34 (14 %) prípadoch. V literatúre sa udáva záchyt patológií v kostnej dreni pacientov v rozsahu od 37 do 55 %(9,11,12). Ostatní pacienti mali negatívny nález. Štúdie, ktoré by uvádzali záchyt abnormalít z plnej periférnej krvi, nie sú k dispozícii. Na základe našich výsledkov môžeme konštatovať, že kostná dreň je oproti periférnej krvi vhodnejším biologickým materiálom na analýzy. Tu samotné ochorenie vzniká, je tu vyšší výskyt patologických buniek, a tým aj vyšší záchyt aberácií.

Z výsledkov vzoriek kostnej drene 383 pacientov, ktorí boli vyšetrení minimálne dvomi metódami z metód cytogenetiky, FISH a MLPA, boli charakterizované prítomné abnormality a následne bol stanovený výskyt tých najčastejších. V tabuľke 4 sú porovnané naše údaje výskytu jednotlivých patológií so štúdiou s dostupnými údajmi. Naše údaje sa s literatúrou vo veľkej miere zhodujú. Tiež pomery izolovaných a kombinovaných chromozómových zmien sa zhodujú. Vzniknuté rozdiely môžu byť spôsobené rôznou veľkosťou porovnávaných súborov. Použitím výsledkov z vyšetrení získaných metódami cytogenetiky, FISH a MLPA bola stanovená prognóza pacientov. Hodnotené bolo zastúpenie pacientov v prognostických skupinách a ich medián prežívania. Prognóza pacientov bola určená prítomnosťou daných abnormalít v genóme. Porovnaním našich dát so štúdiami vypracovanými na iných pracoviskách bola pozorovaná významná korelácia dosiahnutých výsledkov. Naše výsledky prognóz pacientov porovnané s inými štúdiami sú uvedené v tabuľke 5. Spolu s prognózou sme vypočítali  medián  prežívania  351  pacientom v jednotlivých rizikových skupinách. Výpočtom sme získali relevantné výsledky pre skupiny: stredná, zlá a veľmi zlá. Pre skupiny s veľmi dobrým a dobrým rizikom sme nemali postačujúce údaje. Náš súbor pacientov bol sledovaný počas 2 rokov a pacienti z týchto skupín často dosahujú prežívanie vyššie než 2 roky, priemerne od 5,3 do 8,7 roka(19). Štatisticky sme pre tieto dve skupiny dosiahli prognostickú hodnotu, pri ktorej neklesla pravdepodobnosť prežitia pod 0,5 (50 %). Medián prežívania v strednej prognostickej skupine tvoril 1,6 roka. V zlej prognostickej skupine bol 1,3 roka a vo veľmi zlej prognostickej skupine mal hodnotu len 0,2 roka. Naše dosiahnuté výsledky a porovnanie s inými štúdiami sú zobrazené v tabuľke 6.

Dôvodom, prečo nám vyšli nižšie hodnoty mediánu prežívania a nedosiahli sme výsledky pre skupiny s veľmi dobrou a dobrou prognózou, môže byť krátke obdobie sledovania pacientov. Naše výsledky potvrdili, že so zhoršovaním prognózy sa skracuje celkové prežívanie pacientov.

Porovnávali sme tiež úspešnosť použitých diagnostických metód. Vyhodnocovali sme súbor pacientov, ktorí boli naraz vyšetrení všetkými troma metódami. Pacienti nemohli mať negatívny nález a metódy museli zachytiť aspoň jednu abnormalitu. FISH metóda sa ukázala ako najcitlivejšia na odhalenie prítomnosti patológií. Úspešne zachytila patológiu v 85 % prípadov. FISH má vysokú citlivosť a špecificitu k cieľovej oblasti v DNA. Deteguje abnormality s rozlíšením od 100 kb do 1 Mb, ale zachytí len oblasť chromozómu, pri ktorej je použitá sonda. Analýza karyotypu (75 %) a metóda MLPA (74 %) preukázali porovnateľnú úspešnosť. Karyotypová analýza zachytáva numerické a štruktúrne aberácie naraz na všetkých chromozómoch do detekčného limitu okolo 5 Mb a je obmedzená neúspešnou kultiváciou buniek v médiu(20).

Metóda MLPA umožňuje súčasne skríning 46 špecifických oblastí, v ktorých sú zahrnuté aj menej frekventované MDS abnormality. Jej obmedzením je však to, že nedokáže zachytiť balansované genetické prestavby a potrebuje aspoň 25 – 30 % postihnutých buniek vo vzorke(21).

Záver

Incidencia MDS v súčasnosti v Európe stúpa a predpokladá sa každoročne nárast o 25 000 nových prípadov. Dôvodom je nielen starnutie populácie, ale aj nárast znečistenia prostredia. Preto je veľmi dôležitá presná diagnostika pacientov, správne stanovenie prognózy a následne nastavenie vhodnej terapie. V diagnostike aberácií sa dnes využívajú štandardné genetické metódy ako cytogenetické vyšetrenie karyotypu, metóda FISH a MLPA analýza, z ktorých má každá svoje nezameniteľné miesto a ich vzájomná kombinácia je zárukou zachytenia čo najväčšieho počtu aberácií v genóme pacienta s MDS.

LITERATÚRA

1. Vondráková Myelodysplastický syndrom, diagnostika a léčba. Interni Med 2010; 12(11): 535-539.
2. Germing U, Kobbe G, Haas R, Gattermann Myelodysplastic syndromes: diagnosis, prognosis and treatment. Dtsch Arztebl Int 2013; 110(46): 783-790. doi: 10.3238/arztebl.2013.0783.
3. Rau ATK, Shreedhara AK, Kumar Myelodysplastic Syndromes in Children: Where Are We Today? Ochsner J. 2012; 12(3): 216-220.
4. Neuwirtová R. Myelodysplastický syndrom: onkohematologické onemocnění vyššího věku. Čes Ger Rev 2005; 3(2): 21-28.
5. Adès L, Itzykson R, Fenaux Myelodysplastic syndromes. Lancet 2014; 383(9936): 2239-2252.
6. Larson RA. Therapy-related myeloid neoplasms. Haematologica 2009; 94(4): 454-459.
7. Haase D, Germing U, Schanz J, et New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood 2007; 110(13): 4385-4395.
8. Jonas BA, Greenberg MDS prognostic scoring systems – past, present, and future. Best Pract Res Clin Haematol 2015; 28(1): 3-13.
9. Greenberg PL, Tuechler H, Schanz J, et Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes. Blood 2012; 120(12): 2454-65.
10. Zatkova A, Merk S, Wendehack M, et AML/MDS with 11q/MLL Amplification Show Characteristic Gene Expression Signature and Interplay of DNA Copy Number Changes. GENES, CHROMOSOMES & CANCER 2009; 48: 510-520.
11. Haase Cytogenetic features in myelodysplastic syndromes. Ann Hematol 2008; 87(7): 515-526.
12. Schanz J, Tüchler H, Solé F, et New comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes (MDS) and oligoblastic acute myeloid leukemia after MDS derived from an international database merge. J Clin Oncol 2012; 30(8): 820-829.
13. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, et Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res 2002; 30(12): e57.
14. Donahue AC, Abdool AK, Gaur R, et Multiplex ligation-dependent probe amplification for detection of chromosomal abnormalities in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia. Leuk Res 2011; 35(11): 1477-83.
15. Sidney LE, Branch MJ, Dunphy SE, et Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells 2014; 32(6): 1380-89.
16. Marisavljevic D, Kraguljac-Kurtovic Biological implications of circulating CD34(+) cells in myelodysplastic syndromes. J BUON 2010; 15(4): 753-757.
17. Liang X, Xu K, Xu J, et Preparation of immunomagnetic nanoparticles and their application in the separation of mouse CD34+ hematopoietic stem cells. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2009; 321(12): 1885-88.
18. Demirer GS, Okur AC, Kizilel Synthesis and design of biologically inspired biocompatible iron oxide nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B 2015; 3: 7831-7849.
19. https://www.mds-foundation.org/wp-content/uploads/2011/12/2-Revised-pdf
20. https://wwbiomnis.com/wpcontent/uploads/2016/04/56-INTGB-Focus_ Karyotyping_SNP_array.pdf
21. http://www.mlpa.com/WebForms/WebFormDBData.aspx?Tag=_G1U3P- YAOzf2SFuaxkiqa4YjruAIwx3T3q8uAJJ_V-Ws