*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper. 

Úvod

Chronická myelocytová leukémia (CML) je klonálna porucha hematopoetickej kmeňovej bunky s diferenciáciou prevažne do myeloidného radu. Typickým cytogenetickým  nálezom je prítomnosť tzv. chromozómu Philadelphia (Ph), ktorý je výsledkom recipročnej translokácie medzi dlhými ramenami chromozómov 9 a 22, t(9;22)(q34;q11), ktorá je identifikovateľná u viac ako 95 % chorých s CML. Produktom tejto translokácie je fúzny gén BCR–ABL, ktorý kóduje chimérické proteíny (p190, p210, p230). Najčastejšie sa vyskytujúcim z nich je proteín p210 s konštitutívnou aktivitou tyrozínkinázy  (TK). Jeho  podiel  na patogenéze CML a výslednom leukemickom fenotype sa v súčasnosti  považuje za kľúčový (1). Približne u 5 % pacientov s CML nie je možné dokázať Ph chromozóm, ale majú dokázaný fúzny gén BCR–ABL. Ochorenie sa označuje ako CML Ph negatívna, BCR–ABL pozitívna (Ph-, BCR–ABL+).

Chronická myelocytová leukémia tvorí približne 15 – 20 % zo všetkých prípadov leukémií dospelých s incidenciou 1 – 1,5 prípadu/100  000 obyvateľov za rok. Ochorenie  sa vyskytuje vo všetkých vekových skupinách, ale výskyt pomaly narastá s vekom. Medián veku v čase diagnózy sa uvádza 61 rokov, v klinických štúdiách dokonca iba 58 rokov. Muži  sú o niečo častejšie  postihnutí  ako ženy (1,4 : 1).

Hoci  k základným  vyšetreniam  na dôkaz ochorenia CML zaraďujeme fyzikálne vyšetrenia  a vyšetrenia krvného obrazu, cytogenetické a molekulové vyšetrenie je kľúčové na potvrdenie diagnózy. Významný je predovšetkým dôkaz onkogénu  BCR–ABL, ktorý kóduje už spomenutý fosfoproteín s tyrozínkinázovou aktivitou. Cieľom liečby CML je dosiahnuť kompletnú molekulovú remisiu, t. j. stav,  keď nie je možné detegovať ochorenie ani na molekulovej úrovni.

Ciele a možnosti liečby CML

Hlavnú  skupinu  liekov, ktorými sa liečia pacienti s CML v súčasnosti, predstavujú inhibítory tyrozínovej kinázy (TKI), ktorých zavedenie  do liečby znamenalo revolúciu v liečbe CML. Imatinib mesylát (IM) je považovaný za liek prvej línie u chorých s novodiagnostikovanou CML v chronickej fáze ochorenia a cieľom  liečby je dosiahnutie  veľkej molekulovej odpovede (MMR). Dosiahnutie MMR do 1 roka sa považuje za významný prediktor hlbokej molekulovej odpovede.

S cieľom zvýšenia počtu odpovedí, ale aj prekonania rezistencie na imatinib sa začal vývoj nových  TKI. V skutočnosti  tieto lieky dokázali rýchlejšie navodenie  vyššieho počtu cytogenetických a molekulových remisií. S týmito cieľmi boli vyvinuté dve nové TKI (dasatinib a nilotinib), t. j. druhogeneračné TKI.

Aj napriek produkcii signifikantne vysokého počtu liečebných odpovedí pri CML, približne u 25 – 30 % pacientov sa vyvinie rezistencia  na liečbu. Jej najčastejšou príčinou je vznik alebo nárast mutácií v BCR–ABL kinázovej doméne, ktorá je aj najčastejšie  uvádzanou  príčinou  získanej rezistencie na imatinib. Mutácia T315I predstavuje významný  klinický problém, pretože je rezistentná k všetkým komerčne dostupným TKI 1. a 2. generácie. Mutácia je spojená s vysokoagresívnym priebehom ochorenia a zlou prognózou, ak nedôjde k rýchlemu terapeutickému zásahu a zmene terapie (ponatinib, danusertib).

Alogénna transplantácia kmeňových krvotvorných buniek je stále považovaná za jedinú dokázateľnú možnosť eradikácie malígneho klonu. V súčasnosti je posunutá  do 3. a 4. línie liečby po zlyhaní druholíniových TKI. Indikovaná  je pacientom, ktorí sú rezistentní na liečbu alebo majú intoleranciu aspoň k jednému z TKI 2. generácie.

V rámci projektu medzinárodnej  spoločnosti pre diagnostiku a liečbu CML ELN (European  LeukemiaNet)  vznikol projekt EUTOS for CML (The European Treatment Outcome  Study for CML), do ktorého sú od roku 2009 zaraďovaní aj pacienti z Českej a Slovenskej republiky. Ide o register CAMELIA a INFINITY. V článku prinášame ELN odporúčania pre manažment pacientov s CML z roku 2013 (2), ktoré sú treťou verziou odporučení  z roku 2006 (3) a 2009 (4).

Cytogenetické vyšetrenie

Cytogenetické vyšetrenie je esenciálne na potvrdenie diagnózy CML a monitorovanie cytogenetickej remisie ochorenia.
Ph pozitívna CML. V čase diagnózy má 95 % pacientov s CML v aspiráte kostnej drene prítomný Ph chromozóm. Asi u 5 – 10 % Ph pozitívnych pacientov Ph chromozóm vznikne variantnou komplexnou translokáciou, do ktorej je zapojených tri a viac chromozómov.

Ph negatívna CML. Približne 5 % pacientov s CML nemá prítomný Ph chromozóm, ale je prítomná  génová  fúzia BCR–ABL. Ide o kryptickú translokáciu t(9;22), ktorá je cytogeneticky nedetegovateľná. Patologický klon je Ph negatívny (Ph-) a zároveň BCR–ABL pozitívny.

Okrem translokáciet(9;22) sa môžu vyskytnúť aj prídavné cytogenetické zmeny, ktoré sú zväčša predzvesťou progresie ochorenia. Delécia 9. chromozómu a variantné translokácie nemajú prognostický význam (5), avšak klonálne chromozómové aberácie (CCA) v Ph+ bunkách (CCA/Ph+) majú negatívnu prognostickú hodnotu, hlavne v prítomnosti tzv. „major zmien“, ako sú duplikácia Ph chromozómu (+Ph); izochromozóm 17q; trizómia 8; trizómia 19 a 21, ale aj strata chromozómu 17p (6, 7).

Cytogenetické vyšetrenie z kostnej drene (CBA – chromosome banding analysis) sa podľa ELN kritérií vykonáva v čase diagnózy a/alebo pri monitorovaní odpovede pacienta na liečbu v 3., 6. a 12. mesiaci liečby až do dosiahnutia kompletnej cytogenetickej remisie (CCyR), následne každých 12 mesiacov. CBA sa vykonáva aj v progresii ochorenia počas liečby, pri zlyhaní liečby, v prípade výskytu myelodysplázie alebo prídavných aberácií v Ph negatívnom klone. Pri výskyte varovných znakov ELN odporúča vyšetriť karyotyp častejšie spolu s molekulovým vyšetrením (tabuľka 1).

FISH (fluorescenčná in situ hybridizácia)

FISH metóda patrí medzi molekulovo-cytogenetické  metódy, ktoré umožňuje  detegovať  aj submikroskopické zmeny chromozómov, čo v prípade CML znamená  napríklad identifikáciu kryptickej translokácie u Ph negatívnych pacientov, stanovenie typu translokácie a identifikáciu mikrodelécií. Zároveň je FISH vyšetrenie schopné identifikovať patologický klon aj v nízkom percentuálnom zastúpení. Cieľom FISH vyšetrenia je stanoviť percentuálne  zastúpenie  patologického  klonu s t(9;22) vo vyšetrovanej populácii buniek (tabuľka 2 a 3).

FISH vyšetrenie z kostnej drene (KD) sa vykonáva v čase diagnózy, keď sa určí typ translokácie. FISH vyšetrenie je nápomocné  najmä vtedy, ak ide o Ph negatívnu CML (potvrdenie  kryptickej translokácie), alebo ak cytogenetické vyšetrenie nie je možné  uskutočniť. Následne sa FISH vykonáva pravidelne až do dosiahnutia kompletnej cytogenetickej remisie (CCyR), potom každých 12 mesiacov (tabuľka 1).

Molekulová analýza

Minimálna reziduálna choroba, počet transkriptov BCR–ABL, sa sleduje metódou  molekulovej analýzy, kvantitatívnou polymerázovou reťazovou reakciou v reálnom čase (qRT-PCR). Molekulovú odpoveď stanovujeme na základe hodnotenia pomeru BCR–ABL ku konkrétnemu génu, najčastejšie ABL v % podľa medzinárodnej stupnice IS (International Scale). Zároveň je nutné poznamenať, že počty kópií kontrolného génu ABL v replikátoch musia mať hodnoty > 10 000. Stupnica  IS bola vyhotovená  na to, aby sa mohli jednotlivé BCR-ABL  hodnoty získané v rôznych laboratóriách navzájom zosúladiť – pomocou  špecifických konverzných faktorov pre dané laboratórium.

IS je založená na dvoch definovaných hodnotách:

• štandardizovaná „baseline/východisková“ hodnota, ktorá je definovaná mediánom hladiny BCR–ABL vo včasnej chronickej fáze CML pred liečbou (IS – 100 %),
• zníženie o 3 log (1 000-násobne)  proti bazálnej hodnote  (IS – 0,1 %) zodpovedá veľkej molekulovej odpovedi (MMR) (8, 9).

Úrovne molekulovej odpovede  pri liečbe CML sú uvedené na obrázku a hodnotenia odpovedí na liečbu u pacientov s CML liečených prvo- a druhogeneračnými TKI sú uvedené v tabuľke 2 a 3. V súčasnosti  sa kladú sprísnené kritériá na monitorovanie hlbokej molekulárnej odpovede, keďže trvalá hlboká molekulárna odpoveď  je nevyhnutným vstupným kritériom v klinických skúšaniach, ktoré skúmajú možnosť dosiahnutia remisie bez liečby.

Predanalytické informácie

Na cytogenetické a FISH vyšetrenie sa odoberá 5 ml periférnej krvi (PK) alebo kostnej drene (KD) do skúmaviek s heparínom lítnym (LiH). Na molekulové vyšetrenie sa odoberá 5 ml PK alebo KD do skúmaviek s EDTA a zároveň 3 ml PK alebo KD do TEMPUS skúmaviek, ktoré obsahujú stabilizačný roztok zamedzujúci degradácii RNA. Vzorky sa do transportu a počas neho uchovávajú pri teplote 4 – 10 ˚C, pričom je potrebné, aby boli vzorky doručené do laboratória čo najskôr.

Literatúra
1. Cortes JE, Nicolini FE, Wetzler M, et al. Subcutaneous omacetaxine mepesuccintae in chronic or accelerated chronic myeloid leukemia resistant to two or more tyrosine-kinase inhibitors including imatinib. Blood. 2011;118:abstract 3761.
2. Baccarani M, Deininger M, Rosti G, et al. European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013. Blood. 2013;122(6):872–884.
3. Baccarani M, Saglio G, Goldman J, et al. European LeukemiaNet. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 2006;108(6):1809–1820.
4. Baccarani M, Cortes J, Pane F, et al. European LeukemiaNet. Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol. 2009;27(35):6041 6051.
5. Fabarius A, Leitner A, Hochhaus A, et al. Schweizerische Arbeitsgemeinschaft fur Klinische Krebsforschung (SAKK) and the German Study Group. Impact of additional cytogenetic aberrations at diagnosis on prognosis of CML: long-term observation of 1151 patients from the randomized CML Study IV. Blood. 2011;118(26):6760–6768.
6. Katarjian HM, Shah NP, Cortes JE, et al. Dasatinib or imatinib in newly diagnosed chronic phase chronic myeloid leukemia: 2-years follow up from a randomized phase 3 trial (DASISION). Blood. 2012;119(5):1123–1129.
7. Faber E, Muzik J, Koza V, et al. Treatment of consecutive patients with chronic myeloid leukaemia in the cooperating centres from the Czech Republic and the whole of Slovakia after 2000 – a report from the population-based CAMELIA Registry. Eur J Haematol. 2012;87(2):157–168.
8. Branford S, Hughes T. Diagnosis and monitoring of chronic myeloid leukemia by qualitative and quantitative RT-PCR. Methods Mol Med. 2008;125:69–92.
9. Branford S. Monitoring after successful therapy for chronic myeloid leukemia. Hematology 2012, ASH. 2012;105–110