*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf
attachment at the end of the paper.

Úvod

Väčšina stopových kovov sú esenciálne výživové prvky pre človeka ale aj pre zvieratá, patria sem selén, zinok, meď, kobalt, mangán, molybdén, chróm, nikel a železo. Medzi významné funkcie stopových prvkov patrí determinácia, mobilizácia a konštantná väzba na biologické ligandy. Niektoré sú využité pri elektrických impulzoch pozdĺž nervových vlákien iné sú stabilnou súčasťou komplexov s enzýmami alebo nukleovými kyselinami prípadne ligandmi. V biologických procesoch sa uplatňujú ako spúšťače, aktivátori ako aj kontrolóri celej škály reakcií. Iná skupina stopových prvkov vytvára pevný statický komplex a stávajú sa integrálnou časťou proteínov a enzýmov. Množstvo biologických systémov sú závislé na dennom príjme stopových prvkov (meď, zinok, mangán).  Oxidatívny stres je významným faktorom v infekčnom procese ak sú v deficite mikroprvky¹. Stopové prvky a niektoré ich zlúčeniny majú antivírusovú aktivitu prostredníctvom inaktivácie celulárnych proteínov. Teda stopové prvky zohrávajú významnú úlohu pri chorobách vyvolanými vírusmi^2-5. Imunitný systém predstavuje významnú zložku organizmu integritujúceho fyziologické funkcie , ktoré eliminujú cudzorodé zložky, infekčné mikróby ako aj odumreté vlastné bunky. Tieto mechanizmy sú zabezpečené prostredníctvom nešpecifickej (vrodenej) alebo špecifickej (získanej) imunity so zložitými procesmi, ktoré sú koordinované celou radou buniek (lymfocyty, makrofágy, antigén prezentujúce bunky a pod.) a molekulárnych látok (cytokínov, imunoglobulínov, imunohormónov). Makrofágy predstavujú bunky prvej línie pri obranných procesoch vyznačujúce sa fagocytačnou, cytotoxickou a sekretorickou aktivitou. Mikroelementy ako zinok, selén, železo, meď a iné významne ovplyvňujú jednotlivé zložky nešpecifickej imunity. Vybrané mikroelementy zohrávajú významnú úlohu v ochrane buniek pred poškodením vyvolané oxidantmi. Fagocyty produkujúce reaktívne oxidanty sa zúčastňujú v ochrane proti infekčným agens. Nedostatok zinku znižuje funkciu NK buniek, pričom prídavok tohto prvku výrazne zlepší aktivitu NK buniek. Poznatky o špecifickom účinku mikroelementov na funkciu neutrofilov sú nejasné⁶.

Stopové prvky sa v tkanivách nachádzajú v koncentrácii nižšej ako 50 ppm (< 50 × 10⁻⁶ g/g). Ich potrebný denný príjem je menší než 50 mg denně.  Hlavné prvky – Fe, I, Cu, Zn, Co, Cr, Mo, Se, F, Mn, Ni, As, Sn, Si, V.

• sú esenciálne – telo si ich nedokáže samo vytvoriť a sú závislé na ich príjem potravou;
• ich nedostatok alebo nadbytok spôsobuje zdravotné problémy.

Hlavnou biochemickou úlohou stopových prvkov je katalytické pôsobenie v enzýmoch a moduláciách enzýmových aktivít. Taktiež majú veľký význam v ochrane pred oxidačným stresom (SOD potrebuje Mn, Cu a Zn).

Pri reakcii akútnej fázy IL-1 a IL-6 spôsobí redistribúciu stopových prvkov (pokles Zn a Fe v sére).

Toxicita − u zdravých jedincov je veľká tolerancia v koncentračnom rozmedzí. U renálnych porúch sa môže horšie vylučovať Se a Cr, Cu a Mn zasa pri chorobách pečene. Stanovujú sa metódou atómovej absorpčnej spektrometrie.

Meď (Cu)

Meď je súčasťou aktívneho centra mnohých (predovšetkým oxidoredukčných) enzýmov. Súvisí to so schopnosťou medi prijať alebo odovzdať elektrón (Cu^{+ –}/ Cu⁺⁺). Príkladom je cytochróm – c oxidáza, posledný článok prenosu elektrónov v terminálnej oxidácii. Ďalší enzým, lyzyloxidáza má význam v syntéze elastínu a kolagénu.

V ľudskom tele je 100 – 150 mg medi. Z gastrointersticiálneho traktu sa meď dostane do krvi, kde sa viaže na albumín, aminokyseliny a transcuprein. Tieto transportné formy sa dostanú do pečene, kde sa meď zabuduje do ceruloplazmínu, ktorý je hlavným transportným proteínom medi.

Doporučená denná dávka je 2- 3 mg. Nutričný nedostatok medi sa v praxi nevyskytuje, v experimente vedie k anémii.

Zinok (Zn)

Zinok je súčasťou aktívneho centra viac ako 300 enzýmov a pre iné bielkoviny je potrebný ako aktivátor alebo stabilizátor štruktúry. Zinok je esenciálny prvok pri syntéze nukleových kyselín a pre funkciu génov. Zvláštnosť zinku v porovnaní s inými stopovými prvkami spočíva v tom, že nie je veľmi aktívny v oxidačno-redukčných reakciách (nekatalyzuje vznik a premenu bioreaktívnych foriem kyslíka). Je schopný vytvoriť 4 koordinačné väzby s atómami síry v cysteínoch alebo s dusíkmi histidínov.

Zinok je prvok, ktorý má vzťah k vnímavosti k niektorým druhom zhubných nádorov. Hrá totiž významnú rolu v tvorbe T-lymfocytov, ktoré majú schopnosť likvidovať nádorové bunky.

Doporučená denná dávka pre dospelých mužov je 10 mg a pre ženy 7 mg.

Deficit zinku v experimente vedie k malformáciám, retardácii rastu, k hypogonadizmu a k zhoršenej funkcii imunitného systému.

Cieľom tejto práce bolo vyvinúť a zvalidovať pracovný postup pre metódu na stanovenie stopových prvkov meď a zinok v krvnom sére pre rutinnú diagnostiku v laboratóriu klinickej biochémie.

Experimentálna časť

Použité prístroje a zariadenia

Na stanovenie stopových prvkov bol použitý atómový absorpčný spektrometer firmy Agilent Technologies 240Z AA (Austrália) s elektrotermickou atomizáciou GTA 120 (Graphite Tube Atomizer) v spojení s automatickým podávačom vzoriek PSD 120 (Programmable Sample Dispenser). Ako ochranný plyn bol použitý argón (0,3l/min). Merania boli analyzované na pyrolytických grafitových kyvetách bez platformy firmy Agilent Technologies (Nemecko). Dávkovaný objem vzoriek bol 20µl pre meď a 10µl pre zinok. Pracovné podmienky pre stanovenie oboch stopových prvkov sú uvedené v tabuľke I a teplotné programy sú uvedené v tabuľke II.

Tabuľka I: Pracovné podmienky pre stanovenie Cu a Zn

Tabuľka II: Teplotný  a časový program pre stanovenie Cu a Zn

*- zaznamenávanie signálu

Chemikálie a roztoky

Kyselina dusičná TraceSELECT^® (Sigma -Aldrich Co., USA); Triton^® X-100 p.a. (Merck, Nemecko), voda TraceSELECT^® (Sigma-Aldrich Co., USA), lyofilizovaný sérový kalibrátor ClinCal^® – Serum Calibrator šarža 243 Recipe^® Chemical + Instruments, Nemecko), štandardný referenčný materiál Seronorm^™ Trace Elements Serum šarža 0903106( SERO AS, Nórsko), kontrolné lyofilizované krvné sérum ClinChek^® s dvoma hladinami kontrol(Level I,II) šarža 347( Recipe^® Chemical + Instruments, Nemecko).

Pracovné postupy

Príprava sérového kalibrátora, kontrolného krvného séra a štandardného referenčného materiálu K lyofilizovanému sérovému kalibrátoru, kontrolnému krvnému séru a štandardnému referenčnému materiálu sme pridali 3ml deionizovanej vody, ktoré sme miešali krúživým pohybom, nechali sme stáť 30 minút pri laboratórnej teplote. Po 30 minútach bolo možné sérový kalibrátor, kontrolné sérum a štandardný referenčný materiál použiť pre stanovenie.

Priame stanovenie

Štandardný referenčný materiál a kontrolné krvné sérum pre priame stanovenie boli riedené 20x 0,2%(v/v) Tritonom X-100 a 1%HNO₃ a sérový kalibrátor bol riedený 20x 0,2%HNO₃ v prípade medi a v prípade zinku bol štandardný referenčný materiál a kontrolné krvné sérum riedené 100x 0,2%(v/v) Tritonom X-100 a 1%HNO₃ a sérový kalibrátor 100x 0,2%HNO₃ priamo v 2ml autosamplerových nádobkach,z ktorých boli následne dávkované do grafitovej kyvety(20µl pre stanovenie medi a 10 µl pre stanovenie zinku). Pre stanovenie obsahu Cu a Zn v sére sa použila metóda kalibračnej krivky, na vyhodnotenie sa použila výška signálu.

Výsledky a diskusia

Optimalizácia teplotného programu

Dôležitým krokom pri stanovení stopových prvkov technikou ETAAS je optimalizácia teploty a času v teplotnom programe. K tejto optimalizácii nám poslúžili krivky termického rozkladu(pyrolýzy) a krivky atomizácie pre meď a zinok(Graf č.1 a 2). Z tejto optimalizácie sme stanovili pre meď teplotu pyrolýzy na 1100°C a teplotu atomizácie na 2200°C a v prípade zinku bola stanovená teplota pyrolýzy 300°C a teplota atomizácie 1900°C.

Ďalším dôležitým krokom bolo použitie Tritonu X-100 na riedenie, aby sme dosiahli reprodukovateľné sušenie všetkých analyzovaných vzoriek. V tabuľke II sú uvedené teplotné a časové programy pre stanovenie medi a zinku.

Linearita a citlivosť

Kalibračné grafy boli lineárne pre celý koncentračný rozsah 5-30 µmol/l pre Cu a 4-35 µmol/l pre Zn, korelačný koeficient kalibračnej krivky Cu bol 0,9992 a kalibračnej krivky Zn bol 0,9995. Citlivosť definovaná ako koncentrácia, ktorá je potrebná na dosiahnutie signálu 0,0044 AU.s. (tzv. charakteristická hmotnosť) bola 12,7 pg pre Cu a 16,3 pg pre Zn.

Správnosť

Správnosť navrhnutého postupu bola overená analýzou štandardného referenčného materiálu krvného séra (Seronorm^™ Trace Elements Serum šarža 0903106) a ďalším kontrolným materiálom krvné sérum ClinChek^® s dvoma hladinami kontrol(Level I,II) šarža 347 (Recipe^® Chemical + Instruments, Nemecko). Počet meraní nasledujúcich za sebou bol rovný 10.    Kompletné vyhodnotenie výsledkov kontrol je uvedené v tabuľke III.

Presnosť

Presnosť bola vypočítaná z nameraných hodnôt pre štandardný referenčný materiál krvného séra Seronorm^™ a kontrolný materiál krvné sérum ClinChek^®. Presnosť sme vyjadrili opakovateľnosťou v počte 10 za sebou nasledujúcich meraní a reprodukovateľnosťou v počte 15 meraní získaných za niekoľko dní (tabuľka III).

Tabuľka III:

Medza detekcie (LOD) a stanovenia (LOQ)

Pre určenie medzí bolo použité 3σ kritérium, ktorým je určená medza detekcie analytu ako trojnásobok smerodajnej odchýlky šumového signálu (LOD). Medza stanovenia bola vypočítaná ako desaťnásobok smerodajnej odchýlky šumového signálu (LOQ). V prípade Cu bola medza detekcie 0,18µmol/l a medza stanovenia 0,61µmol/l, v prípade Zn bola medza detekcie   0,16µmol/l a medza stanovenia 0,53µmol/l.

Záver

V tejto práci bola vypracovaná analytická metóda pre kvantitatívne stanovenie stopových prvkov meď a zinok v krvnom sére pre rutinnú diagnostiku v laboratóriu klinickej biochémie. Validovaná analytická metóda je prevádzkovo realizovateľná s presnosťou(opakovateľnosť, reprodukovateľnosť) do 5% a správnosťou(výťažnosť) v intervale 85-115% v celom kalibračnom rozsahu.

Poďakovanie

Táto  práca vznikla za podpory projektu Výskumné centrum moderných technológií monitorovania a diagnostiky ochorení ohrozujúcich verejné zdravie s ITMS kódom projektu 26220220197. Tento projekt je súčasťou operačného programu Výskum a vývoj, ktorý je spolufinancovaný Európskou úniou z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Literatúra

1. Evans, P. and Halliwell, B., Micronutrients: oxidant/antioxidant status. Br. J. Nutr. (Suppl.), 2001, 85, 67–74.
2. van der Strate, B. W., Beljaars, L., Molema, G., Harmsen, M. C. and Meijer, D. K., Antiviral activities of lactoferrin. Antiviral Res., 2001, 52, 225–239.
3. Sherrington, C. A. and Olynyk, J. K., Iron as a cofactor in chronic hepatitis C infection. Liver, 2002, 22, 187–189.
4. Semba, R. D., Iron-deficiency anemia and the cycle of poverty among human immunodeficiency virus-infected women in the inner city. Clin. Infect. Dis. (Suppl.), 2003, 37, 105–111.
5. Bhaskaram, P., Micronutrient malnutrition, infection and immunity: An overview. Nutr. Rev., 2002, 60, 40–45.
6. Erickson, K. L., Medina, E. A. and Hubbard, N. E., Micronutrients and innate immunity. J. Infect. Dis. (Suppl.), 2000, 182, 5– 10.
7. Rácz O., Šipulová A., Metabolizmus stopových prvkov, 19-24

„Tento článok vznikol na základe výskumných aktivít v projekte, ktorý bol podporený v rámci OP Výskum a vývoj, s názvom: Výskumné centrum moderných technológií monitorovania a diagnostiky ochorení ohrozujúcich verejné zdravie, ITMS 26220220197, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja“.