*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper.

Vitamíny rozpustné v tukoch sú látky potrebné pre správne fungovanie organizmu.  Spolu s proteínmi, tukmi a sacharidmi patria k základným zložkám našej potravy. Vitamíny z tejto skupiny pôsobia pri metabolických procesoch (katabolizmus, anabolizmus) ako katalyzátory. Vďaka ich rozpustnosti v tukoch majú spoločný absorpčný mechanizmus z GITu ako tuky. Ich nedostatok môže byť spôsobený zníženým príjmom potravy s obsahom tukov alebo poruchou  vstrebávania (malabsorpcia) tukov.

Vitamín E je tvorený niekoľkými analógmi tokoferolu (α-, β-, γ-, δ-) a ich príslušnými nenasýtenými tokotrienolmi. Vitamín E je silným antioxidantom významne účinný v kombinácií s inými rastlinnými antioxidantmi. Je známe, že spomaľuje proces starnutia buniek, chráni tkanivo kože, očí, pečene. Monitorovanie statusu vitamínu E  významne pomáha pri odhaľovaní nedostatočného príjmu vitamínov z potravy. Taktiež pri nedostatku α-tokoferol transportného proteínu, ktorý napomáha  zabudovaniu α- tokoferolu do lipoproteíných častíc (VLDL)  v pečeni.

Experimentálna časť

 Chemikálie a vzorky

Všetky chemikálie potrebné na prípravu mobilnej fázy a prípravu vzorky boli HPLC analytickej čistoty. Metanol, etanol a voda boli zakúpené z firmy Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko). Štandardný roztok α-tokoferolu (vitamín E), butylovaný hydroxytoluén (BHT) boli zakúpené z firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), certifikovaný referenčný materiál pre vitamín α-tokoferol- CRM ClinChek^® Control bol zakúpený z firmy Recipe (Nemecko).

Odber a príprava  vzoriek

Vzorky pacientov boli po odbere centrifugované a sérum  uskladnené  pri teplote – 20 °C až do ďalšieho spracovania. Vzorky boli spracované v  polypropylénových skúmavkách (eppendorf). 50µl séra bolo precipitované  pridanín 100µl etanolu (vychladený na 4 °C) obsahujúceho stabilizátor BHT (1%). Takto pripravená vzorka bola 5min. premiešávaná na trepačke a následne centrifugovaná (8000x g, 5min.). Do HPLC bolo injekovaných 20μl supernatantu.

Chromatografická  technika a doplnkový materiál

Merania boli realizované na kvapalinovom chromatografe HPLC Agilent 1260 série (Agilent Technologies, Singapur). Na detekciu bol použitý 6410 Agilent trojitý kvadrupól s elektrosprejom (ESI).  Ióny boli detekované v pozitívnom móde vysoko špecifickou a citlivou technikou mnohonásobného monitorovania odozvy (MRM – multiple reaction monitoring).  Retenčný čas, prekurzorový a produktový ión, rovnako ako iné parametre analytu sú uvedené v tabuľke 1. Dáta na kvantitatívne stanovenie vitamínu boli vyhodnocované cez MassHunter Workstation Software (Agilent). Na chromatografickú analýzu bola použitá analytická kolóna Kinetex C18 100A 4,6 x 50mm, 2.6μm (Phenomenex, CA,USA) a predkolóna Security Guard Cartridge C18 4,0 x 3.0mm.

Výsledky a diskusia

Príprava a stabilita vzoriek

Štandardné roztoky boli stabilizované BHT (1g.l^-1) a skladované pri -20 °C. Vzorky pacientov po odbere boli centrifugované v chladenej centrifúge  a po centrifugovaní zmrazené pri -20°C. Stabilita vzoriek za takýchto podmienok bola 3 mesiace.

Chromatografická analýza

Pri separácii vitamínu E bola použitá analytická kolóna s reverznou fázou. Pri výbere kolóny, mobilnej fázy a iných parametrov sa postupovalo tak, aby sme v  krátkom čase dosiahli čo najlepšiu separáciu analytu. V tabuľke 2 sú uvedené testované parametre a optimálne podmienky separácie vitamínu E. Koncentrácia vitamínu v sére bola vypočítaná z externej kalibračnej krivky. Zo zásobného roztoku 2,32 mmol.l^-1 α – tokoferolu v metanole bol pripravený pracovný roztok 232 μmol.l^–1. Z pracovného roztoku boli riedenín s  BHT (1g.l^-1) pripravené štandardné kalibračné roztoky  α-tokoferolu v rozsahu (7,25; 14,5; 29,0; 38,6 a 58,0 μmol.l^–1) – obrázok 2)).  V tomto rozsahu kalibračných štandardných roztokov bola testovaná linearita metódy. Medza detekcia (LOD) bola stanovená ako koncentrácia analytu vo vzorke, ktorá v použitom detekčnom systéme vykazovala zvolenú hodnotu  pomer signál / šum >5. Hodnota medze  detekcie pre α-tokoferol bola 0,01 μmol.l^-1. Medza stanovenia (LOQ) bola vypočítaná ako dvojnásobok LOD.

Pri validácii parametrov metódy (opakovateteľnosť, reprodukovateľnosť, výťažnosť) bol použitý referenčný materiál CRM ClinChek^® Control od Recipe (Nemecko). Opakovateľnosť bola stanovená päťnásťnásobným opakovaným stanovením kontrolného séra pri dvoch hladinách v jeden deň. Z tabuľky 3 vyplýva, že opakovateľnosť pre α-tokoferol vyjadrená variačným koeficientom (CV)  neprekročila 5,0%. Reprodukovateľnosť bola  stanovená opakovaným stanovením kontrolného séra pri dvoch hladinách počas šiestich dní. Získané hodnoty variačného koeficientu boli 5,4% a 5,1%.

Výťažnosť (správnosť ) metódy bola overená tak, že k referenčnému materiálu (CRM ClinChek^® Control 1 a 3 ) boli pridávané  štandardy so známou koncentráciou α-tokoferolu (0,68; 1,29 μmol.l^-1) . Výťažnosť bola následne vypočítaná podľa  vzťahu:

Výťažnosť α-tokoferolu pri nízkej koncentračnej hladine bola 95%, pri vyššej koncentračnej hladine 99%. Metóda bola otestovaná na  skupine pacientov (n=30) náhodne vybratých z denného súboru analyzovaných vzoriek. Vekové rozpätie vybratých pacientov bolo 43-69 rokov, z toho 40% žien. Stanovené koncentrácie vitamínu E boli v rozsahu deklarovaných referenčných hodnôt 11,6 – 34,8 μmol.l^-1

  Záver

Vyvinutá metóda stanovenia vitamínu E v sére je založená na princípe LCMSMS. Metóda spĺňa požadované validačné charakteristiky, je  spoľahlivá, citlivá a špecifická. Vzhľadom na uvedené skutočnosti je  možné metódu zaviesť v klinických laboratóriách ako alternatívu stanovenia vitamínu E v rutinnej diagnostike.

Poďakovanie

Táto práca vznikla za podpory projektu ITMS 26220220197.

Literatúra

1. Sies H., Stahl W.: Vitamins E and C, beta carotene and other carotenoids as antioxidant, Am J Clin Nutr. 1995(62): 1315S-21S, ISSN:1938-3207
2. Rino Y, Suzuki Y, Kuroiwa Y, a kol. : Vitamin E malabsorption and neurological consequences after gastrectomy for gastric cancer, Hepatogastroenterology, 2007 54(78):1858-61, ISSN: 0172-6390
3. Pekmezci D. : Vitamin E and immunity, Vitam Horm. 2011(86):179-215, ISSN: 0083-6729
4. Chatzimichalakis P.F, Damanidou V.F, Papadoyannis I.N.: Development of a validated liquid chromatography method for the simultaneous determination of eight fat-soluble vitamins in biological fluids after solid –phase extraction, Journal of Chromatography B, 2004 (805) : 289-296, ISSN: 1570-0232
5. Andreoli R., Manini P., Poli D., at.al: Development of simplified method for the simultaneous determination of retinol, α- tocopherol, and β – carotene in serum by liquid chromatography-Tandem mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization, Anal Bioanal Chem 2004 (378): 98-994, ISSN: 1618-2642
6. JShuing ding. Inez Schoenmakers, Kerry Jones at.al :Quantitative determination of vitamin D metabolites in plasma using UHPLC-MS/MS, Anal Bioanal Chem 2010 (398):779-789, ISSN:1618-2642
7. Moreno P., Salvadó V.: Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 2000 (870): 207-215, ISSN: 0021-9673
8. Abahusain M. A., Wright J., Dickerson J.W.T., at.al: determination of Retinol, α- Tocopherol, and β – Carotene by direct Extraction of Human Serum Using High Performance Liquid Chromatography, Biomedical Chromatography, 1998 (12): 89-93, ISSN: 1099-0801
9. Capote F.P., Jimnez J.R., Granados J.M. Castro M.L.: Identification and determination of fat-soluble vitamins and metabolites in human serum by liquid chromatography/triple quadrupole mass spectrometry with multiple reaction monitoring, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007 (21): 1745-1754, ISSN: 1097-0231
10. Midttun Ø., Ueland P.M.: Determination of vitamins A, D, E in a small volume of human plasma by high-throughput method based on liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2011 (25): 1942-1948, ISSN:1097-0231
11. Grimmelt D.H., Zheng Q., at.al: Comprehensive MRM Analysis of Fat Soluble Vitamins including 25 (OH)- Vitamin D3: Sensitivity and Selectivity by ESI LC/MS/MS, Ionics mass Spectrometry Group Inc.
12. David A, Armbruster TP. : Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation, Clin Biochem Rev, 2008 (29): S49-52, ISSN: 0159-8090
13. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Text and Methodology. ICH-Q2B, Geneva; 1996.
14. Siong T.E, Choo K.S.: Simultaneous determination of retinol and α- tocopherol by high pressure liquid chromatography in micro-volumes of serum, Mal J Nutr. 1999 (5): 21-30, ISSN: 1394-035
15. Talwar D., Ha T.KK., Cooney J., at. al: Routine method for the simultaneous measurment of retinol, α- tocopherol, and five carotenoids in human plasma by reverse phase HPLC, Clinica Chimica Acta 1998 (270): 85-100, ISSN: 1873-3492
16. Li J., Wang Y.: Fat-Soluble Vitamins Analysis on an Agilent ZORBAX Eclipse PAH Polymeric C18 Bonded Column, Application Note from Agilent Technologies (Shanghai) Co. Ltd.
17. Szczesniewski A.: Rapid Analysis of Vitamin D in Serum Using Triple Quadrupole LC/MS,  Application Note from Agilent Technologies, Inc. (Santa Clara), CA USA
18. Khan, A., Khan, M.I., Iqbal, Z., Shah, Y., Ahmad, L. and Watson, D. G. An optimized and validated RP-HPLC/UV detection method for simultaneous determination of all-trans-retinol (vitamin A) and alpha-tocopherol (vitamin E) in human serum, Comparison of different particulate reversed-phase HPLC columns. Chromatogr. B 2010 (878):2339-2347, ISSN: 1570-0232

„Tento článok vznikol na základe výskumných aktivít v projekte, ktorý bol podporený v rámci OP Výskum a vývoj, s názvom: Výskumné centrum moderných technológií monitorovania a diagnostiky ochorení ohrozujúcich verejné zdravie, ITMS 26220220197, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja“.