*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom
PDF súbore na konci štúdie.
Úvod
Mnohopočetý myelóm (MM) patrí medzi hematoonkologické ochorenia plazmatických B-buniek. Vo väčšine prípadov prevláda výskyt nádorových buniek typu zrelých plazmocytov s nízkou proliferačnou aktivitou. Lokalizácia uvedených patologických foriem je striktne viazaná na mikroprostredie kostnej drene, kde prebieha ich proliferácia a diferenciácia(1). MM sa radí do skupiny monoklonálnych gamapatií, pretože jedným z jeho základných znakov je produkcia monoklonálnych protilátok. Za fyziologických podmienok sa v sére zdravého jedinca vyskytujú polyklonálne imunoglobulíny, ktoré sú schopné podliehať rekombináciám a vytvárať tak široké spektrum väzbových miest pre rôzne antigény. Pri monoklonálnych gamapatiách vrátane MM dochádza v organizme k produkcii jedného antigénne i štruktúrne konzistentného antigénu, prípadne jeho fragmentu, čím je značne znížená efektivita imunitného systému. Monoklonálne imunoglobulíny postupne infiltrujú kostnú dreň, kde nahrádzajú funkčné plazmocyty(2).
Patogenéza MM
MM prebieha ako viacúrovňový proces, ktorý sa začína ako premalígne štádium, resp. monoklonálna gamapatia nejasného významu (MGUS) s variabilnou dĺžkou trvania. Od plne rozvinutého patologického stavu sa líši nižšou hodnotou paraproteínu M, kostná dreň obsahuje menej ako 10 % mononukleárnych buniek a nie sú prítomné ďalšie symptómy a poškodenia orgánov(3). „Smoldering“ myelóm (SMM) je heterogénna prechodná forma medzi MGUS a plne rozvinutým ochorením. Odlíšenie SMM a MGUS je možné len na základe hodnotenia laboratórnych výsledkov. Hlavným diferenciačným faktorom je prítomnosť vyššej hladiny paraproteínu (nad 30 g/l) a plazmatických buniek (nad 10 %) v kostnej dreni, ale zároveň nesmú byť u pacienta prítomné žiadne ďalšie príznaky ako hyperkalciémia, poškodenie obličiek alebo anémia(4). Dôsledkom progresie nádorovej masy je tiež potlačenie hostiteľskej imunity, preto počas transformácie SMM na myelóm dochádza k vzniku prídavných deficiencií celulárnych aj humorálnych zložiek imunity. Nastáva postupné zhoršenie orgánových funkcií s možnosťou rozšírenia tumorových buniek do extramedulárnych oblastí, najčastejšie do pečene a sleziny(5).
Molekulová cytogenetika MM
Ako primárne mutácie sa pri MM označujú translokácie zahŕňajúce lokus pre ťažký (IgH) imunoglobulínový reťazec alebo jeden z lokusov pre ľahký Ig reťazec (IgL – kappa/lambda).
Uvedené mutácie sú prítomné u viac ako polovice pacientov. Vznikajú ako dôsledok nesprávnej „crosswitch“ rekombinácie a somatickej hypermutácie protilátok. IgH translokácie zahŕňajú pri MM tri cieľové skupiny onkogénov, uvedené v tabuľke 1. Zvyčajne ide o vyvážené translokácie, počas ktorých sa onkogény dostanú pod kontrolu silného Ig intrónového enhaceru Emu a/alebo IgH alfa(6). V rámci sekundárnych aberácií dochádza pri MM najčastejšie k mutáciám zahŕňajúcim chromozómy 1, 13, 17 a výnimkou nie sú ani translokácie chromozómov 4, 11 a 14. Tumory plazmatických buniek s t(11;14)(q13;q32) sú pri MM a MGUS asociované s nadprodukciou cyklínu D1 (CCND1), ale paradoxne sú pri zavedení vhodnej liečby spojené s dlhším prežívaním pacientov(7).
Waldenströmova makroglobulinémia a gén MYD88
Waldenströmova makroglobulinémia (WM) je lymfoproliferatívne ochorenie B-lymfocytov a zároveň jeden z podtypov non-Hodgkinových lymfómov. Primárnou črtou je infiltrácia kostnej drene patologickými plazmocytárnymi bunkami a prítomnosť Ig monoklonálnej gamapatie. K najčastejším sprievodným javom patrí anémia, hyperviskózny syndróm, hepatosplenomegália či lymfadenopatie. Histologická transformácia buniek býva príčinou progresie ochorenia do štádia difúznej B-bunkovej leukémie (DLBCL), keď dochádza ku komplexnému zhoršeniu symptómov s extramedulárnym postihnutím(8). Kandidátnym génom pri WM je MYD88 (myeloid differentiation primary response 88) lokalizovaný na chromozóme 3p22. Kóduje 31 – 33 kDa adaptorový proteín, ktorý obsahuje N-terminálnu „death“ doménu (DD) a C-terminálnu TIR doménu (Toll/interleukin-1 receptor). Funkciou proteínu je ukotvenie signálnych molekúl na TIR doménu a na receptory pre interferón-γ (IFN-γ) na zabezpečenie správneho fungovania vrodených imunitných reakcií. Deregulácia génu MYD88 má v prevažnej väčšine prípadov negatívny dôsledok na signálne dráhy NF-κB, PI3K/Akt/mTOR či JAK/STAT(9).
Somatická mutácia L265P
Somatický variant (T→C) v chromozómovej oblasti 3p22.2 je jednoznačným diagnostickým markerom WM. Mutácia zapríčiňuje aminokyselinovú zámenu leucínu za prolín (L265P) v géne MYD88, čoho následkom je abnormálne vysoká aktivita uvedených signálnych dráh. Výsledkom komplexného patologického procesu je tak malígna proliferácia a supresia apoptózy B-lymfocytov(10,11).
Diferenciálna diagnostika monoklonálnych gamapatií
Potvrdenie diagnózy monoklonálnych gamapatií zahŕňa sériu biochemických vyšetrení, predovšetkým elektroforézu sérových bielkovín (SPEP) a elektroforézu bielkovín v moči (UPEP). Separácia na klasickej agaróze v kombinácii s imunofixáciou sa využíva ako skríningová metóda na detekciu prítomnosti M-proteínu a jeho ťažkých Ig reťazcov a determináciu ľahkých Ig reťazcov. Pretože uvedené metódy sú relatívne neinvazívne, je vhodné vykonať ich u všetkých pacientov. Pri UPEP je nevyhnutný 24-hodinový odber moču, pretože množstvo M-proteínu v ňom je nepriamym meradlom rozsahu tumorovej masy(12). Metódy fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH) sa rutinne využívajú na analýzu chromozómových aberácií, najčastejšie t(11,14), ktorá priamo súvisí so zvýšenou expresiou CCND1 a je typická práve pre MM. Významným markerom monoklonálnych gamapatií sú tiež prestavby IgH lokusu a časté sú aj delécie 17p13 (TP53) a 13q14 (RB1). Na molekulovej úrovni možno potvrdiť prítomnosť najfrekventovanejších genomických delécií a duplikácií metódou MLPA (multiple ligation-dependent probe amplification). Využitím kvantitatívnej real-time PCR možno sledovať hladinu expresie CCND1, ktorá u pacientov koreluje s mierou liečebnej odpovede.
Problémom v rutinnej praxi je skutočnosť, že výsledky uvedených laboratórnych testov sú pri WM a MM do značnej miery rovnaké, čo môže viesť k nepresnej diagnostike daného ochorenia, a tým aj k podaniu nešpecifickej liečby. U pacientov s MM sa využíva kombinácia cytostatík a kortikosteroidov, prípadne imunomodulačné látky. Medzi najnovšie liečivá z oblasti cielenej terapie MM patrí talidomid, inhibítory VEGF (vascular endothelial growth factor) alebo proteazómové inhibítory(13). U pacientov s WM je pomerne častý výskyt neuropatií a hemolytickej anémie. V danom prípade je prvou voľbou rituximab, ktorý zabezpečuje elimináciu malígnych B-lymfocytov prezentujúcich povrchový antigén CD20. Pri progresii ochorenia sa využíva trojkombinácia DRC (dexametazón, rituximab, cyklofosfamid)(14). Pre aplikáciu vhodného liečebného algoritmu je teda nevyhnutná spoľahlivá diferenciálna diagnostika, ktorou možno odlíšiť uvedené monoklonálne gamapatie na molekulovej úrovni.
Materiál a metodika
Vzorky
Do súboru pacientov s podozrením na Waldenströmovu makroglobulinémiu boli zahrnuté vzorky kostnej drene spracované na oddelení lekárskej genetiky v Medirexe, a. s., v časovom rozmedzí od októbra 2015 do marca 2016. Súbor bol zostavený z 29 vzoriek. DNA na analýzy bola izolovaná kitom QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) podľa priloženého protokolu. Koncentrácia a kvalita vzoriek bola meraná na Implen nanofotometri (Implen GmbH, Munchen, Germany). Ako negatívne kontroly boli použité vzorky od pacientov bez onkologických diagnóz.
Alelovo špecifická PCR (AS-PCR)
Pri optimalizácii vhodnej AS-PCR boli použité komerčne dostupné primery od firmy Sigma-Aldrich pre wild-type a mutovaný typ alel. Reakčné mixy boli pripravené s viacerými druhmi polymeráz vrátane Pfu Turbo Cx Hotstart, AmpliTaq Gold a Phu. Ideálny priebeh reakcie bol dosiahnutý iba v prípade poslednej Phu polymerázy. Genomická DNA bola nariedená na 10 ng a teplotný program bol nastavený podľa článku Varettoni et al., 2013(12). Veľkosť získaných PCR produktov bola približne 300 bp.
Sekvenovanie a MLPA analýza
Získané PCR produkty boli enzymaticky purifikované pomocou Exo Sap (Applied Biosystems, Foster City, USA), ktorý zo zmesi odstráni nezainkorporované primery a dNTP. Na prípravu sekvenačnej reakcie bol použitý BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) a na finálnu purifikáciu DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen, Hilden, Germany) so živicovými kolónkami. Vzorky sme sekvenovali na genetickom analyzátore ABI 3500 (Applied Biosystems, Foster City, USA) a vyhodnotili pomocou softvéru SeqScape. Výsledky sme overili vložením sekvencií do BLAST-u a tiež pomocou MLPA analýzy (MRC Holland, Amsterdam, The Netherlands). Použitý probemix SALA MLPA P038 B1 obsahuje 51 špecifických prób pre B-bunkové aberácie vrátane somatickej mutácie L265P v géne MYD88.
Výsledky
Kombináciou komerčne dostupných primerov, Phu polymerázy a protokolu podľa Varettoni et al., 2013 sme zostavili vhodnú AS-PCR, ktorej produkty možno použiť na ďalšie sekvenovanie a detekciu mutácie v géne MYD88. V našom súbore analyzovaných pacientov sme pozitivitu výsledkov hodnotili na základe zámeny tymínu za cytozín na 978 nukleotide (obrázok 1). Získané výsledky sme potvrdili aj MLPA analýzou (obrázok 2). Uvedenými metódami sa nám podarilo zostaviť diagnostický algoritmus vhodný na detekciu pacientov s WM a odlíšiť ich tak od ostatných prípadov MM či iných monoklonálnych gamapatií. Počas analýzy pacientov sme detegovali aj ďalších 11 polymorfizmov v géne MYD88, ktoré však nemali žiadny fenotypový prejav.
Diskusia
Waldenströmova makroglobulinémia rovnako ako myelóm patrí medzi lymfoproliferatívne ochorenia B-buniek s výskytom monoklonálnych protilátok. Keďže je pomerne ťažké odlíšiť MM od WM na základe klinického obrazu a výsledkov laboratórnych testov, bolo naším cieľom zaviesť do rutinnej diagnostiky molekulovú metódu, ktorá by spoľahlivo identifikovala konkrétny typ ochorenia. Publikácie z posledných rokov uvádzajú somatickú mutáciu L265P v géne MYD88 ako diagnostický marker jedinečný pre WM, pretože pri MM sa nenachádza. WM je relatívne zriedkavé ochorenie v rámci hematoonkologických malignít. Globálne je zaznamenaných približne 5 pacientov na 1 milión prípadov. Počas diagnostiky nových pacientov sme zaznamenali častý výskyt bodových polymorfizmov, najmä 2856 A > R. Vo väčšine prípadov však išlo o silent mutácie a v žiadnom z prípadov sme nedetegovali fenotypový prejav.
Záver
Molekulové metódy majú v laboratórnej praxi nezastupiteľný význam, pretože prispievajú k presnej a relatívne rýchlej diagnostike mnohých ochorení. Pomocou vhodne zvoleného algoritmu je možný spoľahlivý manažment pacientov či samotné sledovanie liečebnej odpovede.
Poďakovanie
Tento článok vznikol vďaka podpore projektu VEGA 1/0906/
Literatúra
1. Boyle EM, Davies FE, Leleu X, et al. Understanding the multiple biological aspect leading to myeloma. Haematologica 2014; 99(4): 605- 612.
2. Matsui W, Wang Q, Barber JP, et al. Clonogenic Multiple Myeloma Progenitors, Stem Cell Properties, and Drug Resistance. Cancer Res 2008; 68(1): 190-197.
3. Chesi M, Bergsagel PL. Molecular pathogenesis of multiple myeloma: basic and clinical updates. Int J Hematol 2013; 97: 313-323.
4. Korde N, Kristinsson SY, Landgren O. Monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) and smoldering multiple myeloma (SMM): novel biological insights and development of early treatment strategies. Blood 2011; 117(21): 5573-5581.
5. Kristinsson SY, Goldin LR, Björkholm M, et al. Genetic and immune-related factors in the pathogenesis of lymphoproliferative and plasma cell malignancies. Haematologica, 2009 94: 1581-1589.
6. Chesi M, Bergsagel PL. Many Multiple Myelomas: Making More of the Molecular Mayhem. Hematology 2011; 344-353.
7. Raab MS, Podar K, Breitkreutz I, et al. Multiple myeloma. Lancet 2009; 374: 324-329.
8. Braggio E, Philipsborn C, Novak A, et al. Molecular Pathogenesis of Waldenström’s Macroglobulinemia. Haematologica 2012; 97(9): 1281-1290.
9. Olson A, Lee MS, Kissner TL, et al. Discovery of Small Molecule Inhibitors of MyD88-Dependent Signaling Pathways Using a Computational Screen. 2015; Online Available: www.nature.com/scientificreports.
10. Treon SP, Hunter ZR. A New Era for Waldenstrom Macroglobulinemia: MYD88 L265P. Blood 2013; 121(22): 4434-4436.
11. Hamadeh F, MacNamara SP, Aguilera NS, et al. MYD88 L265P mutation analysis helps define nodal lymphoplasmacytic lymphoma. Modern Pathology 2015; 28: 564-574.
12. Molle P. Current Trends in the Diagnosis, Therapy and Monitoring of the Monoclonal Gammopathies. Clin Biochem Rev 2009; 30: 93-103.
13. Špička I, Bartúnková J, Campr V, et al. Mnohopočetný myelóm a další monoklonální gamapatie. Praha: Galén 2005. 125p.
14. Ansell SM, Kyle RA, Reeder CB, et al. Diagnosis and Management of Waldenström Macroglobulinemia: Mayo Stratification of Macroglobulinemia and Risk-Adapted Therapy (mSMART) Guidelines, Mayo Clin Proc 2010; 85(9): 824-833.
15. Varettoni M, Arcaini L, Zibellini S, et al. Prevalence and Clinical Significance of the MYD88 (L265P) Somatic Mutation in Waldenström’s Macroglobulinemia and Related Lymhoid Neoplasms. Blood 2013; 121(13): 2522-2528.
