*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf attachment at the end of the paper.

Prvé historické zmienky o tomto ochorení siahajú do stredoveku, keď sa slaný pot u detí spájal s poruchami pankreasu a rizikom včasného úmrtia a tieto deti boli považované za obete bosoráctva. Exaktný medicínsky pohľad na cystickú fibrózu medzi prvými priniesla americká patologička a pediatrička Dorothy Andersenová v roku 1938, keď opísala toto ochorenie v pitevnom náleze ako „cystickú fibrózu pankreasu“. Pre diagnostiku CF bol dôležitý objav zvýšenej koncentrácie chloridov v pote Paulom di Sant’ Agnesom, ktorý sa stal základom dodnes používaného potného testu zavedeného v roku 1953.

O desať rokov sa Dr. Andersenová podieľala aj na vývoji potného testu, ktorý má odvtedy nezastupiteľné miesto  v diagnostike CF. Ďalšími významnými míľnikmi bola identifikácia poruchy chloridového kanála ako základného patofyziologického mechanizmu (1983) a následne objav CFTR génu (1989). Odvtedy sa diagnostika a klinický manažment CF rozvíja míľovými krokmi, čo sa odrazilo na výraznom zlepšení kvality a predĺžení života. Medián veku vo vyspelých krajinách aktuálne dosahuje 37 rokov(1).

Novorodenecký skríning CF na Slovensku

Skríning cystickej fibrózy sa na Slovensku zaviedol od +.9. 2009. Princípom metódy je stanovenie imunoreaktívneho trypsinogénu (IRT) v suchej kvapke krvi podľa algoritmu IRT/IRT, teda dvojstupňového stanovovania hladiny IRT. Trypsinogén je pankreatický proteín – neaktívny prekurzor trypsínu, ktorý sa v dôsledku obštrukcie pankreatických kanálikov pri CF dostáva do krvného obehu. Hraničný limit (cut-off) pre prvý odber (IRT/1) vo vzorke odobratej v 72. – 96. hodine života je 70 ng/ml (99. percentil) a pre druhý odber (IRT/2) medzi 14. – 21. dňom života hodnota 60 ng/ml. Pri celoplošnom novorodeneckom skríningu CF musí byť zohľadňovaný aj etnický pôvod dieťaťa. Skúsenosti z národného referenčného skríningového centra preukázali, že novorodenci rómskeho etnika majú často falošne pozitívne výsledky skríningu a signifikantne vyššie hladiny IRT (až o 34 %) v porovnaní s majoritnou populáciou. Pre rómske etnikum sa preto zvýšila hraničná hodnota IRT/1 na 84 ng/ml a IRT/2 na 72 ng/ml(4). Podobná situácia je dokumentovaná v USA u detí afro-američanov.

Celosvetovo sa pri skríningu cystickej fibrózy uvádza falošná negativita 5 až 9 %(2,3), preto pri zodpovedajúcom klinickom náleze je potrebné zvážiť možnosť CF aj u detí, ktoré absolvovali novorodenecký skríning s negatívnym výsledkom. Nešpecifické zvýšenie hladiny IRT je opísané u novorodencov s perinatálnou asfyxiou a môže viesť k falošnej pozitivite. Vďaka novorodeneckému skríningu sa priemerný vek pri diagnostike ochorenia znížil na 6 až 8 týždňov oproti 14 mesiacom pred zavedením skríningu(3). Identifikácia pacientov s CF novorodeneckým skríningom a skorá liečba vedú k významne lepšej prognóze.

Klinické prejavy cystickej fibrózy

CF je multiorgánové ochorenie, príznaky ochorenia môžu byť u každého pacienta vyjadrené v rôznej intenzite a postihovať rozličné orgány. V novorodeneckom veku je asi u 1/5 detí s CF prítomný tzv. mekóniový ileus. Typické sinopulmonálne príznaky sú chronická rinosínusitída, nosná polypóza, atelektázy, bronchiektázie, paličkovité prsty, perzistujúce infekcie patogénmi typickými pre CF a pľúcne mykobakteriózy, pneumotorax, hemoptýza a alergická bronchopulmonálna aspergilóza. Z prejavov mimo respiračného traktu potom dominujú poruchy tráviaceho traktu: mekóniový ileus, insuficiencia exokrinného pankreasu a recidivujúce pankreatitídy, diabetes mellitus, gastroezofágový reflux, syndróm obštrukcie distálneho čreva, biliárna cirhóza až cirhóza pečene, cholelitiáza, malnutrícia, metabolická kostná choroba a de- ficit vitamínov rozpustných v tukoch (A, D, E, K). Abnormality v mineralograme a acidobázickej rovnováhe sú dôležitými príznakmi CF. Pri akútnej hyponatriemickej dehydratácii dochádza k anorexii, vracaniu, hmotnostnému úbytku s rizikom rozvoja poruchy vedomia a kŕčov. Chronická metabolická alkalóza s hypokaliémiou bola opísaná u dospelého pacienta ako prvý príznak cystickej fibrózy(5).

Diagnostika CF

Pri klinickej suspekcii alebo pozitívnom/hraničom výsledku novorodeneckého skríningu je indikovaný potný test. Ten- to test je založený na stanovení koncentrácie chloridov v pote pilokarpínovou ionoforézou a má senzitivitu asi 95 %. Hodnoty nad 60 mmol/l sú diagnostické pre CF, hodnoty 30 – 59 mmol/l sú označované ako hraničné a diagnóza CF je možná, pri hodnotách pod 30 mmol/l je CF nepravdepodobná. Test a jeho laboratórne vyhodnotenie musia prebiehať podľa stanovených minimálnych štandardov(1). Následne je indikované molekulárnogenetické vyšetrenie CFTR génu, štandardne sa v prvom kroku vyšetruje panel mutácií najčastejších v danej populácii (tabuľka 1).

Ochorenia príbuzné CFTR

Klinické jednotky s dysfunkciou CFTR, ktoré nespĺňajú klinické kritériá pre cystickú fibrózu, sú súhrnne označované ako poruchy príbuzné CFTR (CFTR-related disorders, CFTR-Rds)(6). Podľa aktuálne platných odporúčaní Nadácie pre cystickú fibrózu (Cystic Fibrosis Foundation) z roku 2017 sú definované tri poruchy príbuzné CFTR: rekurentná pankreatitída, kongenitálna bilaterálna agenéza vas deferens (CBAVD) a chronické získané bronchiektázie(7).

Pre prípady pozitívneho novorodeneckého skríningu a intermediárnych hodnôt potného testu sa v USA používa pojem metabolický syndróm príbuzný CFTR (CF transmembrane conductance regulator-related metabolic syndrome, CRMS), ktorý sa prekrýva s jednotkou pozitívny skríning CF, nejednoznačná diagnóza (CF screen positive, inconclusive diagnosis, CFSPID), používanou v ostatných krajinách. U väčšiny detí s poruchami príbuznými CFTR sa v prvých rokoch života nerozvinie obraz cystickej fibrózy. V malej časti sa však rozvíja CF a zatiaľ nie sú dostupné údaje o dlhodobej prognóze týchto pacientov(8,9).

CFTR-RDs a CRMS/CFSPID nahrádzajú nejasné označenia atypická, neklasická alebo neskorá CF používané v minulosti.

Gén CFTR

Gén zodpovedný za CF je označovaný ako CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Je lokalizovaný na 7q31.2, dlhý 250 kb, zložený z 27 exónov dlhých 38 bp až 724 bp(10). Gén kóduje mRNA dlhú 6,5 kb, ktorá je prepisovaná do polypeptidu zloženého z 1 480 aminokyselín.

Proteín CFTR, štruktúra a funkcia

Za fyziologických okolností je CFTR transmembránový proteín fungujúci ako chloridový kanál s regulačnou funkciou pre niektoré ďalšie iónové kanály. Je zložený z piatich funkčných domén, a to z dvoch transmembránových domén TMD1 a TMD2, dvoch domén NBD1 a NBD2 viažucich ATP a jednej veľkej regulačnej domény R, ktorá spája obe polovice polypeptidu. Proteín CFTR je zakotvený v lipidickej dvojvrstve sekretorických buniek, orientovaný je do cytoplazmy (obrázok 1).

Varianty v géne CFTR

V súčasnosti je opísaných takmer 2 000 variantov v géne CFTR, z toho viac než 1 200 patogénnych. Databáza Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium Database CFGAC (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr) obsahuje aktuálny stav variantov CFTR. Jednoznačná väčšina variantov je veľmi zriedkavá a ich výskyt je obmedzený na malé izolované populácie. Len 30 variantov v géne CFTR sa vyskytuje s podielom viac než 0,1 %.
Najčastejším variantom v géne CFTR a prvým identifikovaným(12) je F508del (označovaný aj ako delta-F508, skrátene ∆F508). Je spôsobený deléciou troch báz v 11. exóne génu CFTR, čoho dôsledkom je strata jednej aminokyseliny – fenylalanínu v proteíne CFTR na pozícii 508. Výsledný proteín je nefunkčný. Podiel tohto variantu predstavuje na Slovensku od 59,4 do 66,8 %(13).

Molekulárna patológia

Zastúpenie rôznych variantov v jednotlivých funkčných doménach CFTR je nerovnomerné. Zvýšené množstvo variantov bolo pozorované v doméne R a NBD1. Rôzne typy variantov majú rôzny efekt na priebeh ochorenia. Dôsledkom širokej škály variantov v géne CFTR je veľká fenotypová variabilita CF, ku ktorej prispieva aj vplyv vonkajšieho prostredia a genetického pozadia jedinca.

Mechanizmy vplyvu rôznych variantov na funkčnosť proteínu CFTR môžeme rozdeliť do 5 skupín:

1. Netvorí sa žiaden proteín CFTR alebo len zanedbateľné množstvo z dôvodu predčasnej terminácie translácie z dôvodu predčasných stop kodónov: G542X, 621+1G>T, 390insT.
2. Poruchy posttranslačných úprav, v ktorých dôsledku dochádza k predčasnej degradácii polypeptidov: napr. F508del, N1303K,
3. Poruchy v regulácii spôsobené konformačnými zmenami proteínu CFTR: G551D, G551S, S1255P.
4. Porucha vodivosti chloridového kanála: napr. R117H, R334W,
5. Znížená hladina transkriptu mRNA a následne aj proteínu: 3849+10kbC>T, 1811+1,6kbA>C

Molekulárno-genetická analýza génu CFTR

Molekulovo-genetická analýza sa realizuje zo vzorky periférnej krvi odobratej do sterilnej skúmavky s EDTA. Molekulárna diagnostika CF je založená na identifikácii kauzálnych variantov, ale existencia takmer 2 000 variantov rozptýlených po celom géne CFTR môže spôsobiť falošne negatívny výsledok. Metódou multiplexnej alelovo špecifickej PCR sa vyšetruje 67 variantov v CFTR géne, ktoré predstavujú v našej populácii viac ako 90 % všetkých CF variantov (tabuľka 1).

Na analýzu celého génu CFTR sa využívajú metódy ako dHPLC (denaturing high performance liquid chromatography), HRM (high resolution melting) alebo celogénové sekvenovanie.

Indikácie na testovanie CFTR génu

Indikácie na molekulárnogenetickú analýzu CFTR génu(upravené podľa 14):

1. Diagnostické testovanie pri typických prejavoch CF, pri atypických klinických prejavoch a/alebo hraničných hodnotách potného testu, pri mužskej infertilite s CBAVD a pri ostatných CFTR-RDs u dospelých.
2. Prenatálna diagnostika (napr. v prípade nosičstva mutácií CFTR, pri gravidite s verifikovanou CF u jedného z rodičov alebo u plodu s hyperechogénnym črevom a/alebo dilatáciou črevných kľučiek).
3. Testovanie nosičstva pre CF u jedincov s pozitívnou rodinnou anamnézou. V niektorých krajinách je testovanie nosičstva pre CF zavedené aj u jedincov bez pozitívnej rodinnej anamnézy v rámci vyšetrovania nosičstva pre najčastejšie genetické ochorenia alebo u neplodných párov (neplatí pre SR).

Záver

Genetika v súčasnej dobe predstavuje odbor, ktorý výrazne mení náš pohľad na patofyziológiu ochorení. Cystická fibróza, ako relatívne časté ochorenie, je veľmi podrobne preštudovaná z molekulovo-genetického pohľadu. Od samotného potvrdenia klinickej diagnózy sa dostávame k novorodeneckému skríningu, prenatálnej diagnostike, určovania nosičstva u asymptomatických jedincov, či predimplantačnej diagnostike embryí. Navyše, určenie prítomnosti konkrétnych mutácií nám umožňuje zvoliť najefektívnejšiu liečbu. Cystická fibróza sa takto stáva modelovým ochorením a ukazuje nám potenciál genetickej diagnostiky aj u menej častých monogénových ochorení.

LITERATÚRA

5. Castellania C, Duff AJA, Belle SC, et ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. J Cyst Fibros 2018; 17: 153-178.
6. Dluholucký S, Knapková M. Ročná správa novorodeneckého skríni gu za rok Monitor medicíny SLS 2014; (3-4): 20-24.
7. Lysinová M, Knapková M, Dluholucký S. Novorodenecký skríning v súčasnosti. Pediat prax 2015; 16(5): 188-191.
8. Urbanová V, Feketeová A, Podracká Ľ. Pseudo-Bartterov syndróm ako prvý prejav cystickej fibrózy. Čes-slov Pediat 2015; 70(1): 33-36.
9. Fila Cystická fibróza u dospělých. Interní Med 2014; 16(2): 54-60.
10. Bombieri C, Claustres M, De Boeck K, et Recommendations for the classification of diseases as CFTR-related disorders. J Cyst Fibros 2011; 10: S86-S102.
11. Farrell PM, Terry White, et al. Diagnosis of Cystic Fibrosis: Consensus Guidelines from the Cystic Fibrosis Foundation. J Pediatr 2017; 181S: S4-15.
12. Ren CL, Borowitz DS, Gonska T. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator-Related Metabolic Syndrome and Cystic Fibrosis Screen Positive, Inconclusive J Pediatr 2017; 181: S45-S51.
13. De Boeck K, Vermeulen F, Dupont The diagnosis of cystic fibrosis. Presse Med 2017; 46: e97-e108.
14. Zielanski J, Bozon D, Kerem BS, et Identification of mutations in exons 1 through 8 of the Cystic Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene. Genomics 1991; 10: 229-235.
15. Rowe SM, Miller S, Sorscher EJ. Cystic Fibrosis. The New England Journal of Medicine 2005; 352: 1992-2001.
16. Kerem BS, Rommens JM, Buchanan JA et Identification of the cystic fibrosis gene: Genetic analysis. Science 1989; 245: 1073-1080.
17. Kádasi Ľ, Poláková H, Zaťková A, et Distribution of 9 common mutations in the CFTR gene in Slovak cystic fibrosis patients. Gene Geogr 1997; 11: 51-56.
18. Dequeker E, Stuhrmann M, Morris MA, et Best practice guidelines for molecular genetic diagnosis of cystic fibrosis and CFTR-related disorders – updated European recommendations. European Journal of Human Genetics 2009; 17: 51-65.