*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf attachment at the end of the paper.

Cirkulujúce nádorové bunky

Cirkulujúce nádorové bunky (CTC) sú bunky uvoľňované do krvného riečiska z primárneho nádoru už včasne počas jeho formovania a rastu a/alebo jeho metastázami. Sú preukázateľne asociované s metastázovaním, pričom sú schopné invázie do okolia cez extracelulárnu matrix a vrstvy stromálnych buniek, nasleduje intravazácia týchto buniek do lúmenu ciev, ich transport krvným riečiskom, zachytenie v inej vzdialenej lokalite a následná extravazácia do parenchýmu vzdialeného tkaniva. Bunky ďalej prežívajú v novom mikroprostredí a majú potenciál tvorby mikrometastáz, ak znovu spustia svoj proliferatívny program na danom mieste, čím dávajú vznik makroskopickým, klinicky detegovateľným neoplastickým útvarom(1).

Z cytologického pohľadu sú CTCs heterogénnou skupinou buniek obsahujúcou životaschopné, apoptické, dormantné (spiace) bunky, ako aj bunky schopné založiť metastázu. Ich vnútrobunkové zmeny môžu viesť k vzniku diseminovaných nádorových buniek (DTCs), ktoré sú považované za samotné mikrometastázy. Kým CTCs sú nádorové bunky prítomné v krvnom obehu onkologických pacientov, DTCs sú nádorové bunky, ktoré sa už usídlili v cieľovom tkanive, napríklad v kostnej dreni. DTCs sú najčastejšie detegované a opísané práve v kostnej dreni onkologických pacientov. Jedným z dôvodov je aj to, že tento orgán je ľahšie prístupný pre biopsiu

v porovnaní s inými orgánmi, ako je pečeň, pľúca alebo mozog. DTCs môžu zostať v spiacom stave aj niekoľko rokov po odstránení primárneho nádoru a následne vyvolať vznik metastáz(2). Navyše, DTCs z týchto metastáz sa môžu opätovne uvoľniť do krvného obehu a šíriť sa jeho prostredníctvom do ďalších vzdialených tkanív a vytvárať tak sekundárne metastázy. Dokonca takéto DTCs konvertované spätne na CTCs môžu kolonizovať primárny nádor a už existujúce metastázy v procese nazývanom samovýsev (self-seeding), čím dávajú možnosť vzniku agresívnych typov metastáz(3).

Koncentrácia CTCs

Predpokladá sa, že jeden gram nádorovej masy uvoľňuje denne desaťtisíce CTCs do krvného obehu(4). Ich životnosť v cirkulácii je však časovo veľmi obmedzená a pohybuje sa v rozmedzí 1 – 2,4 hodiny(5). Odhaduje sa, že len asi 1 z 1 000 buniek zostáva v cirkulácii životaschopných a len 1 z 10 000 z týchto CTCs je schopných vytvoriť metastázy(6). Je to tak pre nutnosť prekonania vplyvu hemodynamických síl a pôsobenia buniek imunitného systému (predovšetkým NK buniek)(4). Navyše k tomu prispieva strata kontaktu s okolitými bunkami, a tým spôsobená smrť v procese anoikózy. Vo výsledku sú preto CTCs v periférnej krvi prítomné vo veľmi nízkej koncentrácii, ktorá sa pohybuje medzi 1 – 10 bunkami na 10 ml krvi u väčšiny onkologických pacientov(7).

Prechod CTCs do cirkulácie a epiteliálnomezenchymálny prechod

CTCs sa môžu do cirkulácie dostať dvomi spôsobmi, a to aktívne – vycestovaním buniek so zvýšeným migračným potenciálom, alebo pasívne – uvoľňovaním buď jednotlivých buniek, prípadne bunkových zhlukov. Biologicky významnejšie sú práve tie CTCs, ktoré sú schopné aktívne vycestovať, čo je spojené s ich vstupom do procesu epiteliálno-mezenchymálneho prechodu (EMT)(8).

Epiteliálno-mezenchymálny prechod je proces, ktorý sa fyziologicky uplatňuje počas embryogenézy a zahŕňa migráciu ektodermálnych buniek v embryu počas gastrulácie za vzniku mezodermu (EMT typu I)(9). V neskoršom období hrá veľmi dôležitú úlohu počas hojenia rán, regenerácie tkanív a fibrózy orgánov (EMT typu II)(10) a z pohľadu nádorového tkaniva je spojený s metastatickým šírením (EMT typu III). Umožňuje diferencovaným epitelovým bunkám, ktoré interagujú s bazálnou membránou prostredníctvom ich povrchu, podstúpiť také biologické zmeny, ktoré im umožňujú získať fenotyp mezenchymálnych buniek. Ten zahŕňa zvýšenú migračnú kapacitu, invazívnosť, zvýšenú odolnosť proti apoptóze a značne zvýšenú produkciu zložiek extracelulárnej matrix (ECM)(8). Dokončenie EMT je signalizované degradáciou bazálnej membrány a vytvorenie mezenchymálnych buniek, ktoré sú schopné migrovať z epitelovej vrstvy, z ktorej vznikli (obrázok 1).

EMT je zložitý proces, do ktorého je zapojených viacero signálnych dráh, pretože bunky musia prejsť funkčnými aj morfologickými zmenami. EMT môže byť indukovaný rôznymi mechanizmami, medzi ktoré patrí zápal, acidóza, hypoxia, rastové faktory a v neposlednom rade aj vplyv mikroprostredia nádoru, ktoré môže stimulovať bunkovú migráciu a inváziu. Na druhej strane však ide o reverzibilný proces, keď cirkulujúce nádorové bunky po dosiahnutí vzdialeného orgánu a extravazácii do jeho parenchýmu získavajú znovu fenotyp epiteliálnych buniek v procese nazývanom mezenchymálno-epiteliálny prechod (MET), aby mohli ďalej proliferovať ako epiteliálne metastatické depozity.

Nádorové kmeňové bunky

Malá časť nádorových buniek vykazuje vlastnosti dospelých kmeňových buniek, čiže majú schopnosť samoobnovenia, sú multipotentné a dávajú tak možnosť vzniku diferencovaných nádorových buniek a sú schopné iniciovať rast nádoru. Tieto bunky sú označované ako nádorové kmeňové bunky (CSCs), bunky podobné kmeňovým bunkám, prípadne ako bunky iniciujúce nádor a sú spájané s mezenchymálnym fenotypom.

Cirkulujúce nádorové mikroembólie

Cirkulujúce nádorové bunky môžu v obehu cirkulovať ako samostatné bunky alebo z primárneho tumoru sa môže odlúčiť zároveň viacero buniek, ktoré potom putujú v zhlukoch. Tie môžu obsahovať od dvoch do viac ako 50 buniek a označujú sa ako cirkulujúce nádorové mikroembólie (CTMs). CTMs tvoria buď len nádorové bunky, alebo môžu byť spojené s inými typmi buniek, ako sú fibroblasty, leukocyty, endoteliálne bunky, pericyty, krvné doštičky(12). O významnosti CTC zhlukov sa dlho diskutovalo, avšak CTMs pochádzajúce od pacientov s malobunkovým karcinómom pľúc vykazovali neprítomnosť apoptických buniek, čo im dávalo výhodu v prežívaní, a tiež nízky podiel proliferatívnych buniek, čím sa stávali rezistentnejšími proti chemoterapii(13). Dôležitým zistením tiež bolo, že bunky nachádzajúce sa v CTMs nevznikli delením jedinej migrujúcej bunky, ale sú oligoklonálneho pôvodu a hoci sa v cirkulácii vyskytujú oveľa zriedkavejšie ako samostatné CTCs, majú signifikantne vyšší metastatický potenciál (23- až 50x) a ich prítomnosť je spojená so zhoršeným celkovým prežívaním(14).

Detekcia CTCs

Identifikácia a charakterizácia CTCs si vyžaduje vysokosenzitívne a špecifické metódy, keďže CTCs sa v cirkulácii nachádzajú vo veľmi nízkej koncentrácii, navyše s vysokým pozadím iných krvných buniek (na jednu CTC pripadajú milióny iných krvných buniek). Pri ich detekcii ide zvyčajne o kombináciu izolačných a detekčných metód. Na izoláciu CTCs sa využívajú rôzne technológie, ktoré sú založené na rôznych vlastnostiach CTCs, ktoré ich odlišujú od normálnych hematopoetických buniek. Ide o vlastnosti fyzikálneho (veľkosť, denzita, elektrický náboj, tvarová flexibilita) aj biologického charakteru (expresia proteínov na povrchu buniek, životaschopnosť).

Výhodou technológií využívajúcich fyzikálne vlastnosti je separácia CTCs bez ich farbenia. Patrí sem napr. centrifugácia v hustotnom gradiente (Ficoll, OncoQuick), filtrácia cez špeciálne filtre na základe veľkosti CTCs (ISET), všestranný biočip využívajúci jedinečné rozdiely vo veľkosti a deformovateľnosti nádorových buniek (zachytávané sú väčšie a tuhšie CTCs v porovnaní s krvnými bunkami), fotoakustická prietoková cytometria, dielektroforéza (DEP)(15).

Medzi technológie využívajúce biologické vlastnosti CTCs patria imunofluorescenčné metódy. V tomto prípade sa používajú protilátky proti nádorovo asociovaným antigénom, keď ide o pozitívnu selekciu, alebo protilátky proti bežnému leukocytovému antigénu CD45, keď ide o negatívnu selekciu. Protilátky proti danému antigénu sú naviazané na magnetických partikulách, ktoré umožňujú separáciu CTCs naviazaných na antigén pôsobením magnetického poľa. Pri pozitívnej selekcii sa zvyčajne využívajú protilátky proti adhezívnej molekule epitelových buniek (EpCAM). CTCs sú následne detegované imunocytologicky protilátkami na cytokeratíny (CKs). Medzi metódy využívajúce na separáciu CTCs EpCAM protilátky patrí systém CellSearch®  (Janssen Diagnostics, Raritan, NJ, USA). Tento systém umožňuje stanoviť početnosť CTCs epiteliálneho pôvodu použitím magnetických partikúl pokrytých molekulami EpCAM a CTCs identifikuje podľa morfologických charakteristík, pozitívnej expresie cytokeratínov 8, 18 a/alebo 19 a absencie hematopoetických antigénov CD45(16). Ide o jediný systém, ktorý schválil americký Úrad pre kontrolu liekov a potravín (FDA) ako prostriedok na určenie prognózy u pacientov s metastatickou rakovinou prsníka, prostaty a kolorekta(17-19).

Novými sľubnými metódami založenými na EpCAM sú platformy využívajúce mikrofluidickú technológiu, najmä CTC-čip, Herringbone čip, iCHIP, IsoFlux(12), ktoré umožňujú spracúvať vzorky s veľmi malým objemom.

Biologický význam CTCs epiteliálneho pôvodu (EpCAM a bunky pozitívne na cytokeratín) je zrejmý z prognostickej dôležitosti CTCs, ktoré boli zachytené CellSearch® systémom v rôznych typoch nádorov(17-19). Ak však nejaká časť cirkulujúcich nádorových buniek podstúpi EMT, keď sú downregulované epiteliálne markery, a, naopak, upregulované tie mezenchymálne, dôležitá subpopulácia CTCs nemusí byť metódami, ktoré sú závislé od expresie EpCAM a cytokeratínov, zachytená. Z tohto dôvodu sa na zachytenie CTCs neexprimujúcich EpCAM využíva kokteil protilátok proti rôznym iným epiteliálnym povrchovým antigénom, napr. proti receptoru 2 ľudského epidermálneho rastového faktora (HER2), receptoru pre epidermálny rastový faktor (EGFR), mucín-1 (MUC1) a protilátkam proti mezenchymálnym a kmeňovým bunkovým antigénom (c-MET, N-kadherín, CD318 a antigén mezenchymálnych kmeňových buniek)(20).

Bez ohľadu na výber izolačnej metódy ani jednou jednokrokovou platformou nemožno dosiahnuť izoláciu čistých CT- Cs. CTC frakcia obyčajne stále obsahuje aj značný počet leukocytov. Z tohto dôvodu je potrebná následná identifikácia CTCs na úrovni buniek použitím metód umožňujúcich odlíšiť nádorové bunky od normálnych krvných buniek. Tieto metódy sú založené buď na detekcii proteínov, alebo expresii antigénov asociovaných tumor pomocou kvantitatívnej RT-PCR. V súčasnosti na detekciu viabilných CTCs získaných od onkologických pacientov existujú dva rozdielne in vitro testy. Prvým je EPISPOT, ktorý deteguje špecifické proteíny vylučované CTCs do prostredia(21), druhým je invazívny test, ktorý skúma schopnosť CTCs tráviť fluorescenčne značenú bunkovú matrix(7).

Na detekciu viabilných CTCs možno tiež použiť metódu kvantitatívnej RT-PCR, keď sa vyhodnocuje expresia špecifických mRNA molekúl. V prípade rakoviny prsníka sa najčastejšie využíva mRNA kódujúca CK19. Nevýhodou však je, že táto metóda neumožňuje stanovenie početnosti buniek a navyše mnoho transkriptov (napr. kódujúce CK18, CK19, CK20, MUC1, karcinoembryonálny antigén, prostatický špecifický antigén) je v malom množstve exprimovaných aj v normálnych krvných bunkách a bunkách kostnej drene(22), preto pre správne vyhodnotenie a detekciu viabilných CTCs je potrebná validácia cut-off hodnoty.

Klinické využitie cirkulujúcich nádorových buniek

Potenciálne využitie CTCs v klinickej praxi je rozsiahle, od prognostického a prediktívneho využitia až po detekciu minimálnej reziduálnej choroby a monitorovania ochorenia (obrázok 2).

CTCs ako prognostický a farmakodynamický biomarker. FDA schválila stanovenie početnosti CTCs s presnými cut-off hodnotami a s využitím CellSearch® systému ako prognostic- ký marker vybraných nádorových ochorení. V prípade rakovi- ny prsníka a prostaty je prítomnosť piatich CTCs na 7,5 ml krvi spojená s kratším prežívaním pacientov, pri kolorektál- nom karcinóme (CRC) sú to 3 bunky na 7,5 ml krvi(17-19). Prognostická využiteľnosť enumerácie CTCs s využitím CellSearch® systému bola preukázaná aj v prípade nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC) (cut-off hodnota 5 CTCs na 7,5 ml krvi)(24) a malobunkového karcinómu pľúc (SCLC), pri ktorom sú CTCs prítomné vo vyššom množstve než v ostatných typoch nádorových ochorení (0 – 44 896 buniek na 7,5 ml krvi s cut-off hodnotou 50 CTCs na 7,5 ml krvi)(13).

Okrem použitia CTCs ako markerov prognózy nádorového ochorenia môžu byť CTCs využité ako farmakodynamické biomarkery. V reakcii na liečbu bol zaznamenaný pokles buď celkového počtu CTCs(13,17,18,24) alebo ich subpopulácie(25-27). V prípade väčšiny pacientov s SCLC, bolo podstatne znížené množstvo CTCs po jedinom cykle chemoterapie(13,28) v súlade s vysokou mierou odpovede na liečbu na báze pla- tiny(29). Bolo preukázané, že tieto zmeny sú nezávisle asociované s dobrou prognózou(13). Naopak, nárast počtu CTCs po chemoterapii z priaznivej na nepriaznivú úroveň je spojený s celkovým kratším prežívaním pacientov s rakovinou prsníka, prostaty a CRC(17,18,30). Ďalšie očakávané využitie CTC enumerácie je v ranom štádiu vzniku rakoviny, keď prítomnosť CTCs môže pomôcť vybrať pacientov, u ktorých je pravdepodobnosť, že budú mať prospech z adjuvantnej liečby.

CTCs ako prediktívny biomarker. V ideálnom prípade by CTCs bunky mohli byť využité ako tekuté biopsie, keď by bol výber špecifickej personalizovanej terapie uskutočnený na základe molekulárnych vlastností nádoru pacienta, zistených analýzou CTCs. Táto schéma bola vysvetlená v štúdii analyzujúcich vzorky od pacientov s NSCLC pozitívnych na EGFR mutáciu, v ktorej bola u 19 z 20 pacientov identifikovaná očakávaná (na základe tkanivovej biopsie) aktivujúca EGFR mutácia(31). Ďalším príkladom je analýza prešmyku EML4-ALK, ktorá sa vyskytuje u 3 – 5 % pacientov s NSCLC. Približne 60 % pacientov má dobrú odpoveď na inhibíciu ALK(32,33).  V ďalších štúdiách bola hodnotená expresia HER2 v CTCs v prípade rakoviny prsníka(34) a expresia androgénového receptora v prípade rakoviny prostaty(35,36), ktoré by tiež mohli byť potenciálne využité ako prediktívne biomarkery. Niektoré ženy vykazovali rozdielny HER2 status v CTCs (pozitívny) a v primárnom nádore (negatívny), pričom prosperovali z terapie trastuzumabom(37). Toto zistenie potvrdzuje názor, že vlastnosti CTC buniek sú relevantnejším terapeutickým cieľom, keďže tieto bunky sú zodpovedné za vznik metastáz.

Grantová podpora

Táto publikácia vznikla s podporou grantov Agentúry na podporu výskumu a vývoja – APVV-14-0273 a APVV-14-0327.

LITERATÚRA

11. Fidler The pathogenesis of cancer metastasis: the ,seed and soil‘ hypothesis revisited. Nat Rev Cancer 2003; 3(6): 453-458.
12. Uhr JW, Pantel Controversies in clinical cancer dormancy. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108(30): 12396–12400.
13. Kim MY, Oskarsson T, Acharyya S, Nguyen DX, Zhang XH, Norton L, Massague Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell 2009; 139(7): 1315-1326.
14. Joyce JA, Pollard JW. Microenvironmental regulation of Nat Rev Cancer 2009; 9(4): 239-252.
15. Meng S, Tripathy D, Frenkel EP, et Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clin Cancer Res 2004; 10(24): 8152-8162.
16. Fidler Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor emboli labeled with 125 I-5-iodo-2’-deoxyuridine. J Natl Cancer Inst 1970; 45(4): 773-782.
17. Alix-Panabieres C, Pantel K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer 2014; 14(9): 623-631.
18. Kalluri R, Weinberg The basics of epithelial-mesenchymal transi- tion. J Clin Invest 2009; 119(6): 1420-1428.
19. Edelman GM, Gallin WJ, Delouvee A, et Early epochal maps of two different cell adhesion molecules. Proc Natl Acad Sci U S A 1983; 80(14): 4384-4388.
20. Kim KK, Kugler MC, Wolters PJ, et Alveolar epithelial cell mesenchymal transition develops in vivo during pulmonary fibrosis and is regulated by the extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(35): 13180-13185.
21. Shih JY, Yang PC. The EMT regulator slug and lung carcinogenesis. Carcinogenesis 2011; 32(9): 1299-1304.
22. Krebs MG, Metcalf RL, Carter L, et Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol 2014; 11(3): 129-144.
23. Hou JM, Krebs MG, Lancashire L, et Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor mi- croemboli in patients with small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2012; 30(5): 525-532.
24. Aceto N, Bardia A, Miyamoto DT, et Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell 2014; 158(5): 1110-1122.
25. Alix-Panabieres C, Schwarzenbach H, Pantel K. Circulating tumor cells and circulating tumor Annu Rev Med 2012; 63: 199-215.
26. Riethdorf S, Fritsche H, et Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with metastatic breast cancer: a validation study of the CellSearch system. Clin Cancer Res 2007; 13(3): 920-928.
27. de Bono JS, Scher HI, Montgomery RB, et Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res 2008; 14(19): 6302-6309.
28. Cohen SJ, Punt CJ, Iannotti N, et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall surviv- al in patients with metastatic colorectal J Clin Oncol 2008; 26(19): 3213-3221.
29. Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, et Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 2004; 351(8): 781-791.
30. Pecot CV, Bischoff FZ, Mayer JA, et A novel platform for detection of CK+ and CK-CTCs. Cancer Discov 2011; 1(7): 580-586.
31. Ramirez JM, Fehm T, Orsini M, et Prognostic relevance of viable circulating tumor cells detected by EPISPOT in metastatic breast cancer pa- tients. Clin Chem 2014; 60(1): 214-221.
32. Pantel K, Brakenhoff RH, Brandt Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nat Rev Can- cer 2008; 8(5): 329-340.
33. de Wit S, van Dalum G, Terstappen Detection of circulating tumor cells. Scientifica (Cairo) 2014; 2014: 819362.
34. Krebs MG, Sloane R, Priest L, et Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung can- cer. J Clin Oncol 2011; 29(12): 1556-1563.
35. de Bono JS, Attard G, Adjei A, et Potential applications for circulating tumor cells expressing the insulin-like growth factor-I receptor. Clin Cancer Res 2007; 13(12): 3611-3616.
36. Liu Z, Fusi A, Schmittel A, et Eradication of EGFR-positive circulating tumor cells and objective tumor response with lapatinib and capecit- abine. Cancer Biol Ther 2010; 10(9): 860-864.
37. Riethdorf S, Muller V, Zhang L, et Detection and HER2 expression of circulating tumor cells: prospective monitoring in breast cancer pa- tients treated in the neoadjuvant GeparQuattro trial. Clin Cancer Res 2010; 16(9): 2634-2645.
38. Hiltermann TJ, Pore MM, van den Berg A, et Circulating tumor cells in small-cell lung cancer: a predictive and prognostic factor. Ann Oncol 2012; 23(11): 2937-2942.
39. Evans WK, Osoba D, Feld R, Shepherd FA, Bazos MJ, DeBoer Etopo- side (VP-16) and cisplatin: an effective treatment for relapse in small-cell lung cancer. J Clin Oncol 1985; 3(1): 65-71.
40. Hayes DF, Cristofanilli M, Budd GT, et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall Clin Cancer Res 2006; 12(14 Pt 1): 4218-4224.
41. Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S, et Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells. N Engl J Med 2008; 359(4): 366-377.
42. Shaw AT, Kim DW, Nakagawa K, et al. Crizotinib versus chemother- apy in advanced ALK-positive lung N Engl J Med 2013; 368(25): 2385-2394.
43. Camidge DR, Bang YJ, Kwak EL, et Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung cancer: updated results from a phase 1 study. Lancet Oncol 2012; 13(10): 1011-1019.
44. Hayes DF, Walker TM, Singh B, et Monitoring expression of HER-2 on circulating epithelial cells in patients with advanced breast cancer. Int J Oncol 2002; 21(5): 1111-1117.
45. Attard G, Swennenhuis JF, Olmos D, et Characterization of ERG, AR and PTEN gene status in circulating tumor cells from patients with castration-resistant prostate cancer. Cancer Res 2009; 69(7): 2912-2918.
46. Jiang Y, Palma JF, Agus DB, et Detection of androgen receptor mutations in circulating tumor cells in castration-resistant prostate cancer. Clin Chem 2010; 56(9): 1492-1495.
47. Liu Y, Liu Q, Wang T, et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive bio- marker. BMC Cancer 2013; 13:202.