*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper.

Úvod

Akútne myeloidné leukémie (AML) predstavujú heterogénnu skupinu malígnych ochorení charakterizovaných nekontrolovanou proliferáciou a akumuláciou nezrelých hematopoetických  buniek v kostnej dreni (KD) a následným vyplavovaním do periférnej krvi (PK). Dochádza  ku klonálnej expanzii myeloblastov, ktoré tvoria ≥ 20 % buniek v kostnej dreni alebo v periférnej krvi. AML predstavuje 2 – 4 % všetkých malígnych nádorov a incidencia ochorenia je 2 – 3 prípady na 100 000 obyvateľov/rok. AML sa vyskytuje sa vo všetkých vekových skupinách, avšak s vekom výskyt ochorenia stúpa a incidencia nad 65 rokov je 12 – 15 prípadov na 100 000 obyvateľov a je mierne vyššia u mužov ako u žien (1).

Dôležitými determinantmi AML sú cytogenetické zmeny. V čase diagnózy sa vyskytujú klonálne chromozómové aberácie približne u 50 až 60 % pacientov. Pacientov môžeme na základe klinických a genetických znakov rozdeliť do troch prognostických skupín (2):

• s priaznivou prognózou – t(8;21), t(15;17), inv(16),
• so strednou prognózou – normálny  karyotyp, t(9;11), del(11q), del(7q), del(9q), del(20q), +8,+11,+13,+21,
• s nepriaznivou prognózou – komplexný karyotyp, prestavby 11q23, inv(3)/t(3;3).

Častým cieľom prestavieb v hematologických  malignitách  je gén KMT2A  (starší názov MLL) lokalizovaný na chromozóme  11 v oblasti 11q23. Je to protoonkogén s dĺžkou 89 kb, pozostávajúci  z 36 exónov. Kóduje jadrový proteín s 430 kDa, ktorý má dôležitú úlohu v regulácii transkripcie HOX génov, ktoré participujú na kontrole embryonálneho  vývoja a na diferenciácii hematopoetických  buniek (3, 4).

Reciproké translokácie predstavujú najčastejšiu formu prestavby KMT2A génu u pacientov s AML. 11q23 lokus je vysoko promiskuitný a v súčasnosti je identifikovaných viac ako 70 rôznych fúznych partnerov, s ktorými sa vyskytuje v prestavbe. Fúzny gén vzniká fúziou 5´-konca KMT2A génu a 3´-konca partnerského génu. Výsledný fúzny proteín spô- sobuje zmenu fyziologických vlastností MLL proteínu, čo má za následok leukemickú transformáciu prekurzorových hematopoetických buniek (5). Prognóza  translokácie  závisí od fúzneho partnera, avšak pri väčšine prestavieb je nepriaznivá (4, 6).

Delécie dlhého ramena chromozómu  11 patria  k zriedkavejším  cytogenetickým zmenám (~ 1 %) a predstavujú intermediárnu prognózu. Dochádza k nim v rôznych oblastiach, ale všetkým pacientom  chýba KMT2A gén.

K ďalším, zriedkavo detegovaným  prestavbám  KMT2A génu, patria nebalansované translokácie, adície, duplikácie, amplifikácie, inverzie a inzercie (7).

Kazuistika

Predstavujeme zaujímavý prípad mladej 34-ročnej pacientky, ktorej bola v júni 2014 stanovená diagnóza AML-M2 podľa FAB klasifikácie. V čase diagnózy mala pacientka v KD prítomných 85 % blastov a zo vzorky KD sme uskutočnili vstupné genetické vyšetrenie.

Výsledky

Cytogenetické a FISH vyšetrenie

Cytogenetickou analýzou metafáz pripravených 24-hodinovou kultiváciou buniek KD sme odhalili drobnú translokáciu t(11;17)(q23;q25) (obrázok 1) a stanovili karyotyp 46,XX,t(11;17)(q23;q25). Translokáciu sme potvrdili aj použitím celochromozómových  sond 11a 17 (obrázok 2) a zároveň sme pomocou fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH) potvrdili aj prestavbu KMT2A génu v 88 % vyšetrených interfázových jadrách za použitia sondy XL MLL plus (Metasystems).

Tri mesiace  po stanovení diagnózy (9/2014) a dosiahnutí remisie podstúpila pacientka nepríbuzenskú alogénnu transplantáciu krvotvorných buniek  (TKB). Darcom  bol muž, ktorý bol nositeľom  fyziologickej pericentrickej inverzie chromozómu  3 (obrázok 3). Počas nasledujúceho roka chodila pacientka na pravidelné kontrolné vyšetrenia, ktoré boli negatívne. Až vyšetrenie z januára 2016 odhalilo relaps ochorenia  a k primárnej cytogenetickej zmene – translokácii t(11;17)(q23;q25), pribudla sekundárna zmena – delécia dlhého ramena druhého chromozómu  11-del(11)(q14) (obrázok 4). Sondou  XL MLL plus (Metasystems)  sme potvrdili prítomnosť len jedného KMT2A  génu v prestavbe, druhý signál v dôsledku delécie chýbal (obrázok 5). Posledné vyšetrenia sme uskutočnili v marci 2016, keď sme na cytogenetickej úrovni detegovali len metafázy donora, avšak na FISH úrovni bola ešte v 23 % prítomná prestavba KMT2A  génu.

Molekulová analýza

Na molekulovej úrovni sme v čase diagnózy uskutočnili multiplexovú analýzu PCR AMLplex (Mentype), ktorá umožňuje analýzu 11 základných fúznych  transkriptov pri AML (AML1–ETO, BCR-ABL, CALM-AF10, CBFB– MYH11, DEK-CAN, MLL-AF6, MLL-AF9, MLL-PTD, NPM1-MLF1, PML-RARA) s 31 transkripčnými variantmi. Výsledok bol negatívny, nebola dokázaná žiadna zo spomenutých translokácií. V čase diagnózy a počas kontrol sa analyzoval aj W T1 gén, ktorého nadexpresia bola pozorovaná u 90 % pacientov s AML.  V leukocytoch  kostnej drene zdrav ých jedincov sa hladina expresie W T1 génu pohybuje rádovo 10-2 NCN (normalizovaný počet kópií ). V čase diagnózy a počas relapsu sme vo vzorkách KD pacientky zaznamenali zvýšenú hladinu expresie WT1 génu, ktorá koreluje s klinickým priebehom  ochorenia  (8). Výsledky všetkých  vyšetrení  sú zhrnuté v tabuľke 1.

Chimérizmus – monitorovanie stavu krvotvorby po transplantácii krvotvorných buniek

Pacientka podstúpila v septembri 2014 alogénnu nepríbuzenskú transplantáciu krvotvorných buniek a v súčasnosti je 611 dní po transplan- tácii. Chimérizmus bol na molekulovej úrovni v pravidelných intervaloch monitorovaný (Mentype). V 12/2014 bola potvrdená 100 % krvotvorba darcu (kompletný chimérizmus). Tá však bola postupne, ako je uvedené v grafe 1, vytláčaná hematopoézou  pacientky (zmiešaný chimérizmus). Percentuálne zastúpenia krvotvorby darcu a recipienta – pacientky, v kostnej dreni (KD) a periférnej krvi (PK) sú z druhého roku po transplantácii.

Diskusia

Približne 10 % všetkých leukémií a 3 – 4 % všetkých AML prípadov má prestavbu KMT2A  génu, ktorá sa častejšie vyskytuje u mladších pacientov s AML de novo ako u starších pacientov, čo sa potvrdilo aj u našej pacientky  (3). Prognóza  pacientov  s translokáciou  je rôzna, závisí od translokačného partnera. Dodnes bolo klonovaných a charakterizovaných na molekulovej úrovni viac ako 70 rôznych partnerských génov a nové sú stále objavované a opisované  (9). K najčastejšie vyskytujúcim sa translokáciám patria t(11;19)(q23;p13), t(9;11)(22;q23) a t(10;11)(p12;q23). Translokácie s lokusom 11q23 patria do nepriaznivej prognostickej skupiny okrem t(9;11)(p22;q23), ktorá má signifikantne dlhšie prežívanie a spája sa so strednou prognózou. V našej práci opisujeme  zriedkavú translokáciu t(11;17)(q23;q25) detegovanú na cytogenetickej úrovni v čase diagnózy. Translokácie sa zúčastňuje z chromozómu  11 gén KMT2A a z chromozómu 17 pravdepodobne gén SEPT9. Gén SEPT9 je členom  septínovej rodiny, ktorú tvorí 5 génov. Septíny sú GTP-viažuce  proteíny a majú dôležitú úlohu v procesoch bunkového delenia a zachovania bunkovej integrity. Translokácia t(11;17)(q23;q25) bola okrem pacientov s AML opísaná aj u pacientov so sekundárnou AML, akútnou lymfoblastovou leukémiou (ALL) a veľmi zriedkavo u pacientov s myelodysplastickým syndrómom (MDS) a ako väčšina prestavieb s KMT2A je spojená so zlou prognózou (10). Chen et al. (11) vo svojej práci uvádzajú ako najčastejšie sa vyskytujúce sekundárne aberácie k prestavbe KMT2A  génu deléciu chromozómov  5, 7, komplexný  karyotyp a trizómiu chromozómu 8. Deléciu  chromozómu 11, akú sme detegovali u našej pacientky, nezaznamenali. Strata funkcie oboch génov KMT2A súčasne je veľmi ojedinelý jav a zatiaľ nie sú žiadne literárne údaje o výskyte a prognóze.

Záver

Cytogenetická analýza je nenahraditeľnou súčasťou vyšetrovacích metód v diagnostike hematologických malignít. Umožňuje získať celkový karyotypový obraz pacienta a odhaliť aj rôzne štruktúrové a numerické aberácie, ktoré sú inými metódami nedetegovateľné. Umožňuje ich sledovať v čase diagnózy, počas liečby alebo relapsu. S FISH analýzou a molekulovou metódou sa navzájom dopĺňajú, spolu umožňujú detegovať široké spektrum aberácií a majú dôležitú úlohu v stanovení prognózy, klasifikácii a manažmente pacienta. Prognóza našej pacientky je vzhľadom na danú translokáciu a neprítomnosť  ani jedného  „zdravého“ a neporušeného KMT2A génu veľmi nepriaznivá. Pacientka  je v súčasnosti v zlom stave, rezistentná na chemoterapiu,  vo floridnej fáze ochorenia.

Poďakovanie: Ďakujem všetkým kolegom, ktorí sa podieľali na príprave a vyšetrovaní vzoriek pacientky na cytogenetickej, FISH a molekulovej úrovni počas uplynulých dvoch rokov.

Literatúra
1. Doubek M, Mayer J. Akútní myeloidní leukemie. In: Pospíšilová Š, Dvořáková D, Mayer J, et al. Molekulární hematologie. Praha, Czech Republic: Galén; 2013: 209–224.

2. Yohe S. Molecular Genetic Markers in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 2015;460–478.

3. Ilencikova D, Kolenova A. MLL Gene Alterations in Acute Myeloid Leukaemia (11q23/MLL+
AML), Oncogene and Cancer – From Bench to Clinic [online]. Dr. Yahwardiah Siregar, ed.
InTech. 2013. DOI: 10.5772/55141. Available from: <http://www.intechopen.com/books/oncogene-
and-cancer-from-bench-to-clinic/mll-gene-alterations-in-acute-myeloid-leukaemia-
11q23-mll-aml>.

4. Launay E, Henry C, Meyer C, et al. MLL-SEPT5 fusion transcript in infant acute myeliod leukemia
with t(11;22)(q23;q11). Leukemia & Lymphoma. 2014;55(3):662–667.

5. Mejstříková S, Dvořáková D. Akútní myeloidní leukémie s abnormalitami genu MLL.
In: Pospíšilová Š, Dvořáková D, Mayer J, et al. Molekulární hematologie. Praha, Czech Republic:
Galén; 2013: 220.

6. Saito H, Otsubo K, Kakimoto A, et al. Emergence of two unrelated clones in acute myeloid
leukemia with MLL-SEPT9 fusion transcript. Cancer Genet Cytogenet. 2010;201:111–115.

7. Zhao X, Li S, Li N, et al. 11q23 abnormalities in adult Chinese patients with hematological
malignancies. Med Oncol. 2014;31:115.

8. Ilenčíková D, Sýkora J, Mikulášová Z, et al. Identifikácia molekulárnych markerov u detí
s akútnou myeloblastovou leukémiou (AML). Klin Onkol. 2015;25(1):26–35.

9. Zhang Y, Chen A, Yan X-M, et a. Disordered epigenetic regulation in MLL-related leukemia.
Int J Hematol. 2012;96(4):428–37.

10. Lee SG, Park TS, Seung HO, et al. De novo Acue Myeloid Leukemia Associated with t(11;17)
(q23;q25) and MLL-SEPT9 Rearrangement in an Elderly Patient: A Case Study and Review of
the Literature. Acta Haematol. 2011;126:195–198.

11. Chen Y, Kantarjian H, Pierce S, et al. Prognostic significance of 11q23 aberrations in adult
acute myeloid leukemia and the role of allogeneic stem cell transplantation. Leukemia.
2013;27:836–842.