*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf attachment at the end of the paper.

Úvod

Termín myeloproliferatívne neoplázie (MPN) označuje skupinu ochorení, ktorých patogenéza sa začína transformáciou pluripotentnej kmeňovej bunky. V transformovanej bunke dochádza k somatickým mutáciám, ktoré poskytujú selektívnu výhodu pre patologický klon, ktorý potláča fyziologickú

hemopoézu. Dôsledkom tohto procesu dochádza aj k vývoju krvných elementov z jedného hematologického radu, ktorý výrazne prevyšuje ostatné(1). Základné rozdelenie MPN je založené na prítomnosti, resp. neprítomnosti Philadelphia (Ph) chromozómu. Medzi Ph pozitívne neoplázie patrí chronická myelocytová leukémia (CML) s prítomnosťou BCR–ABL1 fúzie. Ph negatívne MPN zvyčajne nesú somatickú driver mutáciu v génoch JAK2, CALR alebo MPL, ktoré sú hlavnými diagnostickými markermi spolu s hematologickými a morfologickými abnormalitami. Transformácia ochorenia do myelodysplastického syndrómu (MDS) alebo sekundárnej akútnej myeloidnej leukémie (AML) je možná pri Ph+ aj Ph– MPN(2).

Ph negatívne MPN

Medzi Ph– MPN sú zaradené neoplázie bez BCR–ABL1 fúzie. Táto skupina zahŕňa pravú polycytémiu (PV), esenciálnu trombocytémiu (ET) a primárnu myelofibrózu (PMF). WHO klasifikácia MPN je založená najmä na morfologických zmenách v kostnej dreni a počte krvných elementov v periférnej krvi. Trombocytóza je hlavným znakom pre ET, ale býva prítomná aj pri iných MPN. Erytrocytóza je diagnostickým znakom pre PV a leukocytóza sa vyskytuje u pacientov s pokročilým štádiom ochorenia. Pacienti s PMF majú často kombináciu prejavov, avšak v signifikantnej časti sa vyskytuje najmä anémia. Na diferenciálnu diagnostiku uvedených ochorení sa v rutinnej praxi využíva detekcia somatických mutácií na molekulovej úrovni. Vo viac ako 95 % prípadov sú za vznik MPN zodpovedné driver mutácie v génoch JAK2, CALR a MPL(3). Štandardným postupom pri určení diagnózy je detekcia mutácie JAK2 (V617F) a v prípade negativity sa pokračuje detekciou mutácií JAK2 v exóne 12 – 15. Pozitívny nález je v takomto prípade indikátorom PV. V prípade negatívneho výsledku pokračuje vyšetrenie analýzou génu CALR, v ktorom sa vyskytujú najmä frame-shift (FS) mutácie posledného exónu, čo ma za následok vznik alternatívneho C-konca v peptide. Ak nie sú prítomné ani mutácie v géne CALR, vyšetrenie je v poslednom kroku zamerané na detekciu MPL (W515L/K). Prítomnosť somatických mutácií v génoch CALR a MPL je v priamej súvislosti s diagnózami ET a PMF, ktorých patogenéza postihuje megakaryocytovú líniu buniek. ET súvisí najmä s megakaryocytovou proliferáciou a PMF s diferenciáciou – myelodyspláziou(4). Na základe poslednej WHO reklasifikácie myeloproliferatívnych neoplázií z roku 2016 bolo nevyhnutné zahrnúť do rutinnej molekulovogeneticke diagnostiky ďalšie gény pre správne zaradeni pacientov do jednotlivých skupín, určenie liečebnej stratégie a prognózy, monitorovanie MRD (minimálna reziduálna choroba) a na posúdenie zaradenia do transplantačného programu. Požadované gény zahŕňajú ASXL1, IDH1/IDH2, SF3B1, SRSF2, DNMT3A, TET2 a EZH2(5). Vhodnou alternatívou simultánneho vyšetrenia viacerých génov, resp. vybraných exónov a hotspotových oblastí bolo zavedenie panelového NGS do rutinnej diagnostiky myeloproliferatívnych neoplázií.

Next generation sequencing (NGS)

Najčastejšie využívaným postupom pri NGS je tzv. sequencing by synthesis (SBS) od firmy Illumina. Proces spočíva v tom, že počas cyklu DNA syntézy sú fluorescenčne značené dNTP inkorporované do templátového vlákna pomocou DNA polymerázy. V každom cykle je daný nukleotid identifikovaný prostredníctvom excitácie fluorofóru. Pred samotným sekvenovaním je potrebná príprava tzv. knižnice. Základným princípom prípravy knižníc je fragmentácia DNA, prípadne cDNA s následnou modifikáciou 3’ a 5’ koncov vlákien, na ktorých dochádza k ligácii adaptérov. K jednotlivým vzorkám sa počas prípravy pridáva unikátna kombinácia adaptérov, čo umožňuje multiplexovú analýzu (do 96 vzoriek). Fragmenty DNA s viazanými adaptérmi sú následne amplifikované pomocou PCR reakcie a prečistené podľa príslušného protokolu(6). Na tvorbu klastrov je potrebná hybridizácia amplifikovaných knižníc na flow-cell. Na jej povrchu sa nachádzajú oligonukleotidy komplementárne k sekvenciám adaptérov. Po hybridizácii nastáva tvorba klastrov prostredníctvom mostíkovej amplifikácie, počas ktorej DNA polymeráza vytvorí komplementárne vlákno k templátu. Pôvodné vlákno je odmyté a ponechané je nové, reverzné. Na konci reverzného vlákna sa nachádza adaptérová sekvencia, pomocou ktorej sa nové vlákno prichytí na komplementárny oligonukleotid na povrchu flow-cell. DNA polymeráza tak vytvorí nové komplementárne vlákno identické s pôvodným templátom. Vzniknutá dsDNA je denaturovaná, a tak sa môže samostatne každé vlákno opäť prichytiť adaptérom na príslušný oligonukleotid (obrázok 1). Uvedeným spôsobom vznikajú naraz vo vzorke tisícky klastrov, ktoré sú sekvenované v priebehu 2-3 dní. Prítomnosť konkrétnej bázy vo vlákne DNA je detegovaná pomocou štyroch reverzibilných terminátorov, ktoré sú značené fluroescenčnými farbivami s rozdielnou emisiou. Sekvenátor (MiSeq System, Illumina) po každom cykle odfotí fluorescenčné signály na flow-cell a po ukončení analýzy poskladá výslednú sekvenciu(8).

Súbor pacientov

V roku 2018 bolo do rutinnej diagnostiky zavedené panelové sekvenovanie TruSight Myeloid Sequencing Panel, Illumina. Do súboru bolo zatiaľ zaradených 56 pacientov. Použitým materiálom bola gDNA získaná izoláciou z plnej kostnej drene a periférnej krvi. Do vyšetrenia boli zahrnutí pacienti s diagnózou zo skupiny myeloproliferatívnych neoplázií. Najčastejšie išlo o pacientov nereagujúcich na liečbu s podozrením na prítomnosť mutácie v iných génoch, ako JAK2, CALR a MPL, u pacientov s ťažko definovateľnou diagnózou z dôvodu polyfenotypového prejavu ochorenia alebo v prípade predikcie úspešnosti transplantačného procesu.

Materiál a metódy

Na oddelení lekárskej genetiky, Medirex, a. s., bolo medzi rutinné vyšetrenia pacientov s MPN zavedené panelové sekvenovanie TruSight Myeloid Sequencing Panel, Illumina. Uvedená metóda slúži na detekciu somatických variantov, ktorých výskyt je typický najmä pre akútnu myeloidnú leukémiu (AML), myelodysplastický syndróm (MDS), myeloproliferatívne neoplázie (MPN), chronickú myeloidnú leukémiu (CML), chronickú myelomonocytovú leukémiu (CMML) a juvenilnú myelomonocytovú leukémiu (JMML). Uvedený panel pokrýva 15 génov (exóny) a v 39 génoch zahŕňa hotspotové oblasti (tabuľka 1). Okrem génov JAK2, CALR a MPL zahŕňa všetky ostatné gény potrebné na diagnostiku MPN podľa najnovšej WHO klasifikácie z roku 2016. Vstupným materiálom je gDNA s koncentráciou 50 ng na reakciu. Použitá bola chémia MiSeq Reagent Kit v3 v kombinácii s nano-flow-cell, čo umožňuje simultánnu analýzu 8 vzoriek. Veľkosť výsledných amplikónov je ~250 bp. Získané výsledky boli hodnotené v softvéroch Finalist Dx, Ingenuity a IGV. Do správy pre klinikov boli uvedené iba sekvenčné varianty s patogénnym a pravdepodobne patogénnym významom, s počtom čítaní aspoň 500x a alelovou frekvenciou nad 5 %.

Výsledky

Pacient 1.

46-ročná pacientka liečená od roku 2009 s diagnózou PV vo FNsP F. D. Roosevelta v Banskej Bystrici. V roku 2017 progresia ochorenia do sekundárnej myelofibrózy. V marci 2018 na oddelení lekárskej genetiky, Medirex, a. s., bola panelovým NGS detegovaná prítomnosť sekvenčného variantu JAK2 (V617F) s patogénnym významom a alelovou frekvenciou 50 %. V tom istom mesiaci bola prítomnosť uvedenej mutácie potvrdená metódou real-time PCR s 53 % zastúpením. V apríli 2018 bola pacientka zaradená do transplantačného programu v Nemocnici sv. Cyrila a Metoda v Bratislave. V tom čase bola kvantita mutovaného JAK2 už 73 %. V júni 2018 bol prvýkrát vyšetrený chimérizmus po transplantácii. Hodnota pôvodnej autológnej krvotvorby klesla pod 2 % a JAK2 (V617F) na 0,64 %.

Pacient 2.

49-ročný pacient bol v apríli 2018 odoslaný na genetické vyšetrenie do centrálneho laboratória Medirex, a. s., s podozrením na CML. Výsledok analýzy BCR–ABL1 zlomov bol bez nálezu. V tom istom mesiaci boli pomocou FISH vyšetrené gény MLL, CRLF2, ABL2 a molekulovou MLPA analýzou gén IKZF1. Uvedené vyšetrenia mali negatívny výsledok. U pacienta bol zároveň vyšetrený vstupný panel pre AML, z ktorého pozitívny výsledok mala iba hodnota expresie WT1 (NCN = 0,05). V máji 2018 bol u pacienta vyšetrený myeloidný NGS panel, pomocou ktorého bola detegovaná prítomnosť sekvenčného variantu v géne CSF3R (T618I) s patogénnym významom. Alelová frekvencia bola 39 %. V septembri 2018 bolo realizované kontrolné NGS vyšetrenie, ktorým bola dokázaná stúpajúca hodnota mutovaného génu až na 48 %. Hladina expresie WT1 génu mala tiež stúpajúci charakter. U pacienta je podozrenie na relaps.

Pacient 3.

47-ročný pacient liečený v Nemocnici sv. Cyrila a Metoda s diagnózou PV. V roku 2018 prechod do sekundárnej myelofibrózy. V januári 2018 bol vyšetrený vstupný panel pre MPN. Pomocou real-time PCR bola detegovaná prítomnosť mutácie JAK2 (V617F), kvantita 86 %. U pacienta bol následne vyšetrený myeloidný NGS panel, ktorý potvrdil prítomnosť sekvenčných variantov v génoch DNMT3A (R659C) s alelovou frekvenciou 40,2 % a JAK2 (V617F) s alelovou frekvenciou 60,7 %. U pacienta je zvažovaná alogénna transplantácia.

Diskusia

WHO klasifikácia MPN ochorení z roku 2016 zahŕňa nové diagnostické entity podľa prítomnosti genetických variantov (mutácií) vybraných génov. Diagnostické kritériá boli rozšírené vďaka zavádzaniu nových citlivejších metód molekulovej diagnostiky a cielenému sekvenovaniu klinicky relevantných génov. Ďalšie mutácie v génoch, ktoré sa podieľajú na epigenetickej regulácii a signalizácii, zohrávajú kľúčovú úlohu v patogenéze MPN. Mutácie v epigenetických regulátoroch sú zapojené do iniciácie a progresie ochorenia. Cieľom práce bolo zavedenie panelového NGS do rutinnej molekulovogenetickej diagnostiky týchto ochorení. Na analýzu pacientov bol použitý TruSight Myeloid Sequencing Panel od firmy Illumina, ktorým možno analyzovať 54 génov v jednej reakcii. Pomocou uvedeného vyšetrenia sú zachytené aj mutácie s prediktívnym významom pre prognózu a prežívanie pacientov, ale aj na posúdenie úspešnosti transplantačného procesu. Zavedenie panelového NGS má v rutinnej diagnostike významné postavenie, pretože umožňuje aj detekciu takých mutácií, ktoré by pri bežnom vyšetrovacom algoritme vôbec neboli zachytené. Pri PMF sa v čase diagnózy vyskytujú iné mutácie ako v JAK2, CALR a MPL vo viac ako 50 %. Pri PV a ET sú ďalšie mutácie detegované približne v 10 % prípadov.

Mutácia v géne TET2 sa pri PMF vyskytuje v 19 % a ASXL1 až v 40 % prípadov. Obe sú pri MPN asociované so zlou prognózou( 10). Výskyt patogénnych variantov v génoch ASXL1, EZH2, SRSF2 a IDH1/2 indikuje u pacientov výrazne skrátený čas prežívania. V prípadoch s dvomi a viac mutáciami je medián dožitia 2,6 roka, pri jednej mutácii 7 rokov a v prípadoch bez mutácií v uvedených génoch je medián prežívania 12,3 roka(11). Hlavnou výhodou NGS analýzy je simultánna analýza veľkého množstva DNA s vysokou citlivosťou v porovnaní s klasickým Sangerovým sekvenovaním. Sekvenovaním mnohých génov naraz možno vyšetriť aj viaceré diagnózy, čo značne skracuje čas nasadenia vhodnej terapie. NGS analýzou je stanovená aj alelová frekvencia danej mutácie, čo slúži najmä na sledovanie účinku liečby a MRD (minimálna reziduálna choroba). Zatiaľ najväčšou nevýhodou všetkých NGS analýz je veľký objem získaných dát, ktoré musia byť okrem iného vyhodnotené so zreteľom na daný druh ochorenia a pôvod zachytenej mutácie (somatická vs germinálna). V neposlednom rade je pri hodnotení dát potrebné brať ohľad aj na etickú stránku a citlivosť získaných informácií o danom pacientovi v súvislosti s diagnózou.

Záver

Sekvenovanie novej generácie sa v rutinnej diagnostike používa v čoraz vyššej miere a predstavuje významný nástroj na potvrdenie, resp. vylúčenie viacerých diagnóz v jednej analýze. Detekcia patogénnych variantov v daných génoch má diagnostický a prognostický význam u pacientov s myeloproliferatívnymi neopláziami. NGS vyšetrenie je tiež dôležité na stanovenie klonálneho charakteru ochorenia. Najväčšou výzvou do budúcnosti je zefektívnenie vyhodnotenia veľkého objemu získaných dát a zavedenie štandardného postupu na hodnotenie ich kvality.

LITERATÚRA

1. Mead AJ, Mullally A. Myeloproliferative neoplasm stem cells. Blood 2017, 129(12): 1607-161.
2. Spivak JL. Myeloproliferative Neoplasms. N Engl J Med 2017, 376: 2168- 2181.
3. Rumi E, Cazzola M. Diagnosis, risk stratification, and response evaluation in classica myeloproliferative neoplasms. Blood 2017; 129(6): 680‑692.
4. Schalling M, Gleiss A, Gisslinger B, et al. Essential thrombocythemia vs. pre-fibrotic/early primary myelofibrosis: discrimination by laboratory and clinical data. Blood Cancer J 2017; 7(12): 643-647.
5. Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016; 127(20): 2391-2405.
6. Liu L, Li Y, Li S, et al. Comparison of Next-Generation Sequencing Systems. J Biomed Biotechnol 2012; 2012: 251364.
7. Chandran A. Overview of Next-Generation Sequencing Technologies and Its Application in Chemical Biology. In: Advancing Development of Synthetic Gene Regulators. Springer These 2018.
8. Heather JM, Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics 2016; 107(1): 1-8.
9. https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/ trusight-myeloid.html#gene-list
10. Brecqueville M, Rey J, Bertucci F, et al. Mutation analysis of ASXL1, CBL, DNMT3A, IDH1, IDH2, JAK2, MPL, NF1, SF3B1, SUZ12, and TET2 in myeloproliferative neoplasms. Genes Chromosomes Cancer 2012; 51: 743-755.
11. Guglielmelli P, Lasho TL, Rotunno G, et al. The number of prognostically detrimental mutations and prognosis in primary myelofibrosis: an international study of 797 patients. Leukemia 2014; 28(9): 1804-1810.