*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf 
attachment at the end of the paper.

Chronická lymfocytová leukémia z B lymfocytov (B-CLL) je definovaná ako nízkoagresívne lymfoproliferatívne ochorenie zapríčinené klonálnou proliferáciou malígne transformovaných malých zrelých B lymfocytov. Tieto bunky so špecifickým imunofenotypom sa akumulujú v periférnej krvi, kostnej dreni, lymfatických uzlinách, prípadne v iných hemopoetických a non-hemopoetických orgánoch. Príčinou nárastu počtu lymfocytov nie je len ich nadmerná klonálna proliferácia, ale aj porucha apoptózy (1). Podľa kritérií medzinárodného konsenzu o B-CLL (tzv. kritériá IWCLL) je ochorenie definované prítomnosťou monoklonovej lymfocytózy v periférnej krvi nad 5 x 10⁹/l, trvajúcou najmenej 3 mesiace a spoločne so stanovením typického imunofenotypového profilu patologických buniek prietokovou cytometriou sú dostatočnými kritériami na diagnostiku B-CLL (2). WHO klasifikácia sa opiera o laboratórnu diagnostiku B lymfocytov (morfologické, imunofenotypové, genetické, ako aj molekulovo-biologické parametre) a klinické prejavy ochorenia.

B-CLL tvorí cca 25 % – 30 % z leukémií dospelých v Európe a Severnej Amerike, čím sa zaraďuje k najčastejšie sa vyskytujúcim leukémiám (1). Keďže je roky bezpríznaková, často sa diagnostikuje iba náhodne (asi 50 % prípadov) pri vyšetrení parametrov krvného obrazu.

B-CLL sa vyznačuje veľkou heterogenitou a variabilným priebehom ochorenia, ktorý rozdeľuje pacientov na skupinu s indolentným charakterom a na skupinu s agresívnym, rýchlo progredujúcim ochorením a krátkodobým prežívaním (3). Snaha opierať sa pri manažmente terapie o vybrané parametre s prognostickým významom vyplýva z biologickej nehomogénnosti B-CLL rozpoznateľnej na morfologickej, fenotypovej a genetickej úrovni. Koncom 90. rokov 20. storočia vstúpili pri štúdiu biologickej heterogenity B-CLL do popredia genetické a molekulovo-biologické parametre, ktoré umožnili rozdelenie dovtedy známych prognostických markerov na klasické (staré, respektíve klinické) a na molekulové (nové, moderné) (4).

K novým prognostickým markerom zaraďujeme mutačný stav IgV_H génov, expresiu CD38, expresiu ZAP-70, chromozómové abnormality (del17p, del11q, del 6q, trizómia 12 a del 13q)

a mutáciu génu TP53. Prítomnosť somatických mutácií v hypervariabilných úsekoch (IgV_H) génov pre ťažké reťazce imunoglobulínov umožnila zadefinovať prognózu a dĺžku prežívania pacientov. Nemutovaný stav IgV_H génov (homológia vo > 98,0 % sekvencií) koreluje s nepriaznivou prognózou a kratším mediánom prežívania a naopak, za prognosticky priaznivý stav sa považuje prítomnosť somatických mutácií vo ≥ 2,0 % sekvencií (4).

Stanovenie mutačného stavu IgV_H je všeobecne považované za technologicky, časovo i finančne náročné a v súčasnosti ťažko realizovateľné v bežných laboratórnych podmienkach pre náročnosť spracovania materiálu (5).

Expresia CD38 bola prvým markerom, pri ktorom sa preukázala korelácia s IgV_H statusom. CD38 je 45kDa transmembránový glykoproteín, ktorý pôsobí súčasne ako enzým a receptor. Vyšetrenie expresie CD38 na povrchu leukemických buniek prietokovou cytometriou je v klinických laboratóriách relatívne dostupné, avšak jeho použitie ako prognostického markera pri B-CLL sa postupom času ukázalo ako nejednoznačné. Predovšetkým sa nepotvrdila absolútna korelácia expresie s IgV_H mutačným statusom a objavili sa aj rôzne názory na stabilitu expresie antigénu CD38 a na určenie cut-off hodnoty pre pozitivitu CD38 na leukemických bunkách z prognostického hľadiska (hodnoty od 7 % až do 20 %, respektíve 30 %) (6). V súčasnosti sa za klinicky relevantnú mieru expresie považuje arbitrárne (štatisticky) určená hodnota v klinických laboratóriách ≥ 30 % detegovaná prietokovou cytometriou (4). Časť pacientov vykazuje bimodálny profil expresie, najbežnejšie sa pozoruje zmena CD38 negativity na CD38 pozitivitu, ktorá sa často spája s progresiou ochorenia (7).

Expresia proteínu ZAP-70 patrí medzi ďalšie prognosticky významné parametre, o ktorých sa uvažovalo, že nahradia stanovenie IgV_H. ZAP-70, zeta asociovaný proteín s molekulovou hmotnosťou 70 kDa, je kódovaný génom na dlhom ramienku 2. chromozómu v 2q2 lokuse (8). Táto tyrozín kináza z rodiny tzv. Syk proteínov obsahuje dve terminálne SH2 domény a C-terminálnu kinázovú doménu. Miestom primárnej expresie proteínu ZAP-70 je cytoplazma T a NK lymfocytov (9). ZAP-70 proteín bol identifikovaný ako fosforylačný partner zeta reťazca CD3 komplexu asociovaného s TCR (T bunkový receptor) komplexom na T lymfocytoch. Aktivácia T lymfocytov prostredníctvom signálu odovzdávaného cez TCR receptor je nevyhnutná na vývoj imunitnej odpovede, z čoho vyplýva, že ZAP-70 zohráva kľúčovú úlohu v TCR signalizácii. Deficit ZAP-70 má za následok absenciu maturovaných CD8+ lymfocytov, blokuje aktiváciu CD4+ T lymfocytov sprostredkovanú cez TCR a môže spôsobiť autozomálne dedičnú formu ťažkého kombinovaného deficitu špecifickej imunity (Severe Combined Immunodeficiency – SCID) (10). Proteín ZAP-70 exprimujú v rôznej miere aj B lymfocyty a nádorové bunky viacerých typov B NHL vrátane B-CLL (8). Expresia proteínu ZAP-70 koreluje s nemutovaným stavom IgV_H génov, a teda pozitívna expresia ZAP-70 predstavuje nepriaznivú prognózu (9). Pri B-CLL ZAP-70 pravdepodobne zosilňuje signálne dráhy sprostredkované receptorom B lymfocytov, čo je proces prispievajúci k horšej prognóze u ZAP-70 pozitívnych pacientov. Podobne ako pri T lymfocytoch, má ZAP-70 význam pre chemokínovú stimuláciu buniek B-CLL. Predpokladá sa, že expresia ZAP-70 by mohla viesť k migrácii leukemických buniek do mikroprostredia výhodného na prežitie či proliferáciu. Avšak korelácia medzi expresiou ZAP-70 a mutačným stavom IgV_H génov nie je absolútna, a teda prítomnosť diskordantných nálezov (v závislosti od použitej metódy detekcie od 8 % do 25 %) potvrdzuje ZAP-70 ako nezávislý prognostický faktor (4). Pri porovnaní vzájomnej korelácie IgV_H a CD38, respektíve ZAP-70, je štatisticky významnejšia korelácia IgV_H a ZAP-70 (11, 12). Keďže ZAP-70 a CD38 vzájomne nekorelujú, ich súčasné stanovenie má väčšiu výpovednú hodnotu pri identifikácii pacientov s rôznou prognózou než analýza len jedného izolovaného parametra. Kombinovaná analýza CD38 a ZAP-70 umožňuje identifikovať jednak skupinu pacientov s dobrou prognózou, ktorí vykazujú fenotyp CD38-/ZAP-70-, skupinu s nepriaznivou prognózou (fenotyp CD38+/ZAP-70+), ako aj pacientov s diskordantným fenotypom CD38-/ZAP-70+, respektíve CD38+/ZAP-70- a stredným rizikom (13).

Na stanovenie ZAP-70 sa v súčasnosti využívajú imunohistochemické (semikvantitatívne hodnotenie) a imunocytochemické metódy, Western-blotting, analýza mRNA a tiež prietoková cytometria (8). Interpretáciu analýzy pomocou Western-blotingu komplikuje prípadná kontaminácia vzorky T lymfocytmi, čo môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom (14). Preto sa do popredia dostáva snaha o zavedenie spoľahlivej, rutinnej a relatívne jednoduchej metódy pomocou prietokovej cytometrie.

Bolo vypracovaných niekoľko protokolov na detekciu ZAP-70, ako aj odporúčaní na interpretáciu výsledku expresie ZAP-70 (tabuľka 1). Detekciu expresie ZAP-70 prietokovou cytometriou komplikujú viaceré problémy, ku ktorým sa zaraďuje predovšetkým slabá expresia ZAP-70 v cytoplazme patologických B lymfocytov a chýbanie jednotne používanej štandardizovanej metódy (3, 16).

Popri metódach so separovanými mononukleárnymi bunkami sú vypracované protokoly s imunofenotypovou analýzou plnej krvi. Pracovné postupy sa ďalej odlišujú v používaní rôznych klonov anti-ZAP-70 protilátok priamou, respektíve nepriamou imunofluorescenčnou metódou. Pomerne veľká variabilita je aj vo fixačno-permeabilizačných metódach, používaní rôznopočetných multifarebných protokolov a analytickej stratégii (tvorba logických „gate“, určenie cut-off pozitivity) (tabuľka 1).

Pri interpretácii výsledkov analýzy sa autori opierajú o vyjadrenie pozitivity expresie ZAP-70 v percentách, alebo vyjadrujú pomernú priemernú intenzitu fluorescencie (MFI). Expresiu ZAP-70 sa deteguje v percentách vo vzťahu k externej negatívnej, izotypovej kontrole, internej pozitívnej kontrole (T lymfocyty, NK lymfocyty), internej negatívnej kontrole (CD5- B lymfocyty) alebo negatívnej kontrole zdravých kontrol, kde sa cut-off pozitivity ZAP-70 pohybuje v rozmedzí 10 % až 30 %. Pri pomernom vyjadrení MFI sa pozitivita expresie ZAP-70 stanoví koeficientom MFI CD3+ T lymfocytov k MFI CD5+ B lymfocytov (T/CLL B), podielom MFI CD5+ B lymfocytov voči CD5- B lymfocytom (CLL B/B Ly), respektíve T lymfocytom (CLL B/T) (6, 9, 12, 15, 17 – 23).

V porovnaní s IgV_H je cytometrické stanovenie CD38 a ZAP-70 menej finančne a časovo náročné (9). Prietoková cytometria sa stala metódou voľby aj pre svoju relatívnu jednoduchosť a dostupnosť. Umožňuje špecifické ohraničenie cieľovej populácie buniek a odlíšenie expresie ZAP-70 na patologickom klone B lymfocytov od výraznej pozitivity ZAP-70 v cytoplazme T a NK lymfocytov. Expresia ZAP-70 môže byť relevantnejším prognostickým indikátorom definujúcim B-CLL s horšou prognózou pri nemutovanom IgV_H statuse.

Poďakovanie: Práca bola podporená projektom ITMS 26220220197 spolufinancovaným zo zdrojov EÚ (Moderné technológie monitorovania a diagnostiky ochorení ohrozujúcich verejné zdravie).

„Tento článok vznikol na základe výskumných aktivít v projekte, ktorý bol podporený v rámci OP Výskum a vývoj, s názvom: Výskumné centrum moderných technológií monitorovania a diagnostiky ochorení ohrozujúcich verejné zdravie, ITMS 26220220197, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“

Tabuľka 1. Porovnanie niektorých metodík na stanovenie ZAP-70 prietokovou cytometriou

IF – imunofluorescenčná metóda, BD – BectonDickinson, BC – BeckmanCoulter, MIF – Mean Fluorescence Intensity

Literatúra

1. Adam Z, Vorlíček J, et al. Hematologie II: Přehled malígních hematologických nemocí. vyd. Praha, Česká republika: Grada Publishing; 2001: 680.
2. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, Caligaris-Cappio F, Dighiero G, Dohner H, Hillmen P, Keating MJ, Montserrat E, Rai KR, Kipps TJ. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic lymphocytic Leukemia updating the National cancer Institute Working Group 1996 guidelines. 2008;111(12):5446–5456.
3. Váleková Ľ, Chudej J, Sokol J. Laboratórna diagnostika CLL: cytológia, prietoková cytometria. Onkológia. 2014;9(3):166–172.
4. Balhárek T, Barthová M, Szépe P, Marcinek J, Burjanivová T, Plank L. Komentár k vývoju konceptu prognostických faktorov chronickej lymfocytovej leukémie: Cesta od prognostických faktorov k prediktorom liečebnej odpovede. Onkol. 2009;22(6):254–263.
5. Bosh F, Muntanola A, Giné E, Cario A, Villamor N, Moreno C, Crespo M, Montserrat E. Clinical Implications of ZAP-70 Expression in Chronic Lymphocytic Leukemia. Cytometry Part B. 2006;70B:214–217.
6. Rassenti LZ, Kipps TJ. Clinical Utility of Assessing ZAP-70 and CD38 in Chronic Lymphocytic Leukemia. Cytometry Part B. 2006;70B:209–213.
7. van Bockstaele F, Verhasselt B, Philippé J. Prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia: A comprehensive review. Blood Reviews. 2009;23:25–47.
8. Béné MCh. What is ZAP-70? Cytometry Part B. 2006;70B:204–208.
9. Crespo M, Bosh, F, Villamor N, Bellosillo B, Colomer D, et al. ZAP-70 Expression as a Surrogate for Immunoglobulin-Variable-Region Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 2003;348(18):1764–1775.
10. Exbio Bulletin. ZAP-70. 2005: 6.
11. Rassenti LZ, Huynh L, Toy TL, Chen L, Keating MJ, et al. ZAP-70 Compared with Immunoglobulin Heavy-Chain Gene Mutation Status as a Predictor of Disease Progression in Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 2004;351:893–901.
12. Orchard JA, Ibbotson RE, Davis Z, Wiestner A, Rosenwald A, et al. ZAP-70 expression and prognosis in chronic lymphocytic leukaemia. 2004;363:105–111.
13. D´Arena G, Tarnani M, Rumi C, Vaisitti T, Aydin S, et al. Prognostic significance of combined analysis of ZAP-70 and CD38 in chronic lymphocytic leukemia. American Journal of Hematology. 2007;82:787–791.
14. Urbanová A, Janega P, Masárová K, Štefániková Z, Babál P. Imunohistochemická detekcia proteínu ZAP-70 a jej význam v diagnostike B-CLL. Česko-slovenská patologie. 2009;45(2):40–45.
15. Bakke AC, Purtzer Z, Leis J, Huang J. A Robust Ratio etric Method for Analysis of ZAP-70 Expression in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Cytometry Part B. 2006;70B:227–234.
16. Hamblin TJ. Prognostic markers in chronic lymphocytic leukaemia. Best Practice & Research Clinical Haematology. 2007;20:455–468.
17. Shankey TV, Forman M, Scibelli P, Cobb J, Smith CM, et al. An Optimized Whole Blood Method for Flow Cytometric Measurement of ZAP-70 Protein Expression in Chronic Lymphocytic Leukemia. Cytometry Part B. 2006;70B:259–269.
18. Bekkema R, Tadema A, Daenen SMGJ, Kluin Nelemans HC, Mulder AB. An Improved Flow Cytometric Method Using FACS Lysing Solution for Measurement of ZAP-70 Expression in B-Cell Chronic Lymhocytic Leukemia. Cytometry Part B. 2008;74B:40–44.
19. Degheidy HA, Venzon DJ, Farooqui MZH, Abbasi F, Arthur DC. Combined Normal Donor and CLL: Single Tube ZAP-70 Analysis. Cytometry Part B. 2012;82B:67–77.
20. Zucchetto A, Bomben R, Dal Bo M, Nanni P, Bulian P, et al. ZAP-70 Expression in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia: Evaluation by External (Isotypic) or Internal (T/NK Cells) Controls and Correlation with IgV_H Cytometry Part B. 2006;70B:284–292.
21. Chen Y, Peterson LC, Dittmann D, Evens A, Rosen S, et al. Comparative Analysis of Flow Cytometric Techniques in Assessment of ZAP-70 Expression in Relation to IgV_H Mutational Status in Chronic Lymphocytic Leukemia. Am J Clin Pathol. 2007;127:1882–1191.
22. Best OG, Ibbotson RE, Parker AE, Davis ZA, Orchard JA, Osciier DG. ZAP-70 by Flow Cytometry: A Comparison of Different Antibodies, Anticoagulants, and Methods of Analysis. Cytometry Part B. 2006;70B:235–241.
23. Rossi M, Delprincipe MI, Rossi D, Consalvo MI, Luciano F, et al. Prognostic impact of ZAP-70 expression in chronic lymphocytic leukemia: mean fluorescence intensity T/B ratio versus percentage of positive cells. of Translational Medicine. 2010;8:1–11.
24. Slack GW, Wizniak J, Dabbagh L, Shi X, Gelebart P, et al. Flow Cytometric Detection of ZAP-70 in Chronic Lymphocytic Leukemia.Correlatin With Immunocytochemistry and Western Blot Analysis. Arch Pathol Lab Med. 2007;131:50–56.