*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Pneumocystis jirovecii je oportúnny mikroorganizmus, ktorý bol v minulosti označovaný ako Pneumocystis carinii. Táto atypická huba spôsobuje u  ľudí závažnú infekciu nazývanú pneumocystová pneumónia(1). Najčastejšie postihuje ľudí s oslabeným imunitným systémom a v niektorých prípadoch môže vážne ohroziť život. Medzi rizikových pacientov patria osoby s rôznymi chorobnými stavmi, ako sú nádorové ochorenia, HIV infekcia, transplantácie orgánov či užívanie imunosupresívnej terapie a liekov. Pacienti s pneumocystózou klinicky vykazujú symptómy horúčky, kašľa, dýchavičnosti a v závažných prípadoch môže dôjsť k zlyhaniu dýchacích orgánov až smrti. Primárne sa Pneumocystis prenáša z človeka na človeka vzdušnou cestou, boli však opísané aj ďalšie spôsoby prenosu. Takisto sa môže šíriť prostredníctvom asymptomatických nosičov, teda ľudí s normálnym imunitným systémom, ktorí sú kolonizovaní. Napriek statusu najbežnejšej a najvážnejšej oportúnnej respiračnej infekcie u  pacientov s  AIDS v  súčasnosti incidencia ochorenia v populácii klesá v dôsledku zavedenia profylaxie a účinnej antiretrovírusovej terapie(2). Čoraz častejšie sa však pneumocystóza vyskytuje u HIV negatívnych pacientov liečených protinádorovými chemoterapeutikami a imunosupresívnou liečbou(3).
Používaným štandardom v laboratórnej diagnostike pne-umocystózy u pacientov so zníženou imunitou je detekcia P. jirovecii v bronchoalveolárnej laváži (BAL) a vo vzorkách indukovaného spúta prostredníctvom mikroskopického dôkazu(4). Ide o mikroskopický dôkaz cýst alebo trofických foriem parazita v pľúcnom materiáli s použitím viacerých farbiacich techník(5). Postupne však boli vyvinuté vysokocitlivé molekulárne metódy (PCR) detekcie P. jirovecii a konvenčné metódy diagnostiky sa stali menej spoľahlivými(6). Ako minimálne invazívny spôsob diagnostiky pneumocystózy pred-stavujú sérologické metódy.
Vďaka vysokej účinnosti a dostupnosti perorálnych a parenterálnych foriem je liekom voľby trimetoprim-sulfametoxazol pri liečbe miernej až závažnej pneumocystózy u pacientov infikovaných HIV, ale aj u pacientov, ktorí nie sú infikovaní HIV(7).

Materiál a metódy

Počas 19-ročného obdobia sme v rámci štúdie vyšetrili 3 330 pacientov pochádzajúcich z celého Slovenska pre podozrenie na infekciu spôsobenú P. jirovecii. Prevažne išlo bronchoalveolárne laváže a spúta.
Pri mikroskopickom dôkaze sme použili farbenie podľa Giemsa na detekciu trofozoitov a Gramovo a Weigertovo farbenie na determinovanie cýst(8,9). Na izoláciu DNA zo vzoriek sme použili komerčne dostupný DNeasy kit (Qiagen, Hilden, Nemecko). Z metód molekulárnej biológie sme aplikovali klasickú polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) s použitím primerov pAZ102-E a pAZ102-H, ktoré amplifikujú časť génu veľkej podjednotky mitochondriálnej rRNA(10). Pre real-time PCR sme použili komerčnú súpravu LightMix® Kit Pneumocystis jirovecii, kde ako cieľový fragment sa na amplifikáciu využila 244 bp sekvencia multikópiového MSG génu z P. jirovecii.
Výsledky boli analyzované štatistickým softvérom OpenEpi, verzia 3.03 (http://www.openepi.com/Menu/OE_Me-nu.htm) a na vyhodnotenie štatistických rozdielov bol použitý chíkvadrátový test, kde hodnota P < 0,05 sa považovala za významnú(11). Výpovedné hodnoty použitých testov sme vypočítali pomocou štatistického programu MedCalc (http://www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php).

Výsledky

Počas 19 rokov počet vyšetrení a detekcia P. jirovecii stúpa, čo je na grafe 1 vyznačené trendovými lineárnymi spojnicami. Najvyšší nárast vzoriek pozorujeme v rokoch 2008 až 2015, kde sa počet pacientov počas 8 rokov znásobil 6× (387 : 61 = 6,35). V nasledujúcich rokoch od roku 2016 je množstvo vyšetrovaných pacientov relatívne stabilné v rozmedzí od 323 do 369.
Metódami PCR sme pneumocysty zachytili u  5,7  % (190/3 330) vyšetrovaných pacientov, pričom mikroskopicky sme potvrdili mikroorganizmy u 1,9 % (64/3 330) prípadov. U  163 pacientov sme infekt dokázali v  BAL, u  25 v spúte. Prítomnosť P. jirovecii sa potvrdila hlavne u imunokompromitovaných osôb s onkologickým ochorením 57,9 % (110/190), ale aj u pacientov s chorobami dýchacej sústa-vy 23,2 % (44/190), s infekčnými a parazitárnymi chorobami 9,4 % (18/190), s inými ochoreniami 7,4 % (14/190) a s HIV 2,1 % (4/190). Najcitlivejšími skupinami pacientov z hľadiska infekcie pneumocystami sú onkologickí jedinci a pacienti s chorobami dýchacej sústavy (graf 2).

Z celého súboru sme v rokoch 2001 – 2012 vyšetrili 803 pacientov pomocou klasickej PCR, kde sa nám podarilo detegovať DNA P. jirovecii u 48 (6 %) pacientov a u 12 (1,5 %) z nich sme pneumocysty potvrdili aj mikroskopickým dôkazom. V rokoch 2013 – 2019 sme s využitím real-time PCR z 2 527 osôb detegovali DNA P. jirovecii u 142 (5,6 %) a u 52 (2,1 %) z nich sme pneumocysty potvrdili aj mikroskopicky. Na obrázku 1 sú znázornené niektoré naše pozitívne preparáty cýst po farbení podľa Grama a  Weigerta. Morfológia pneumocýst je nepravidelná, majú tvar „defektnej lopty“ a sú s veľkosťou od 4 do 8 μm. V cyste postupným delením vzniká 8 jednojadrových teliesok, tzv. intracystické telieska (obrázok 2).
S cieľom priblíženia klinickej manifestácie infekcie spôsobenej P. jirovecii u onkologického pacienta, kde sme v našom laboratóriu potvrdili etiologický agens, prikladáme rtg. snímku s komplikovanou pneumocystovou infekciou s výrazným škvrnitým zatienením oboch pľúcnych krídiel (obrázok 3).
Štatisticky významné rozdiely pre pacientov s  pneumocystózou sme potvrdili vzhľadom na vekovú skupinu, odobratý biologický materiál a stanovenú diagnózu. Najvyšší podiel infikovaných sme detegovali u dospelých jedincov vo veku od 21 do 40 rokov (9,7 %), ďalej nasledovali deti 0 – 10 rokov (6 %), starí ľudia nad 61 rokov (5,2 %), pacienti medzi 41. a 60. rokom života (4,8 %) a najmenej u 10- až 20-ročných osôb (1,6 %). Tieto rozdiely boli štatisticky významné (p = 0,009). Väčší podiel infikovaných pneumocystami tvorila skupina, v ktorej bol indikovaný odber spúta (9,8 %) ako v porovnaní s odberom BAL (5,4 %; p = 0,029). Signifikantné rozdiely v počtoch pacientov s pneumocystózou sme pozorovali aj v súvislosti s predikovanou diagnózou (p = 0,02). Najvyššie percento (12,5 %) pacientov s pneumocystózou tvorila skupina s diagnózou infekčných a parazitárnych chorôb. Druhú, najviac zastúpenú skupinu (5,8 %) infikovaných tvorili pacienti s diagnózou chorôb dýchacej sústavy, za ktorou nasledovali diagnózy ako ostatné (5,7 %), onkologické choroby (5,1 %), choroby krvi a krvotvorných orgánov s účasťou imunitných mechanizmov (3,7 %) a choroby obehovej sústavy (3,1 %). Žiadnu signifikantnú súvislosť sme nezistili medzi prítomnosťou pneumocystovej infekcie a pohlavím (p > 0,05).
Štatistické ukazovatele spoľahlivosti mikroskopického dôkazu P. jirovecii sme vyjadrili vzhľadom na PCR, ktorú sme považovali za zlatý štandard. Po prepočtoch nám vyšla 33,7 % citlivosť, 100 % špecifickosť, 100 % pozitívna pred-povedaná hodnota a 96,1 % negatívna predpovedaná hodnota mikroskopie v porovnaní s PCR počas celého 19-ročného obdobia vyšetrovania.

Diskusia

Na Slovensku boli publikované iba 2 práce, ktoré dokumentovali výskyt či diagnostické možnosti laboratórnej diagnostiky Pneumocystis jirovecii(12,13). Táto práca podáva komplexný prehľad o  prítomnosti P. jirovecii u  vyšetrovaných pacientov s pľúcnymi komplikáciami na Slovensku za obdobie 19 rokov a poskytuje možnosti laboratórnej diagnostiky v podmienkach rutinného laboratória.
Z  celého súboru vyšetrovaných sme pneumocysty detegovali hlavne u osôb s onkologickým ochorením (najmä lymfatická leukémia). Sing et al.(14) diagnostikovali pneumocysty najviac u jedincov s HIV (6 %), potom nasledovali onkologickí (1,8  %) a  transplantovaní (1,5  %) pacienti. V  našom súbore vyšetrovaných nebol taký veľký počet HIV osôb (1,1 %; 36/3 330), aký mali Sing et al. (26,7 %; 89/334), preto sme mali oveľa nižšie percento HIV pacientov infikovaných pneumocystami. Ale najviac pozitívnych pacientov na P. jirovecii tvorili imunosuprimovaní (60 %), podobne ako v práci Singa et al. (94,3 %). Fillatre et al.(15) sa takisto vo svojej štúdii zaoberali 293 prípadmi pneumocystózy. Z celkového súboru pacientov bolo 154 (52,6 %) prípadov HIV negatívnych. Ako najčastejšie poruchy rozvoja pneumocystózy identifikovali hematologické malignity (32,5 %), ďalej to boli solídne nádory (18,2 %), zápalové ochorenia (14,9 %), transplantácie solídnych orgánov (12,3 %) a vaskulitída (9,7 %). Štúdia Liu  et  al.(3) potvrdila, že najbežnejšou príčinou PJP sú hematologické malignity (29,1 %) podobne ako v štúdii Fillatre et al.(15). Nám približne rovnaké výsledky dokumentovali aj Kim et al.(4), kde malígne ochorenia dosahovali až 68,7 %, a Gazaignes et al.(16), ktorí detegovali PJP u pacientov s nádorovými ochoreniami (60 %). Abastabar et al.(17) podobne ako my zistili, že prevalencia P. jirovecii sa líši podľa veku pacientov. V ich štúdii bol však častejší výskyt PJP u pacientov vo vekovom rozmedzí 71 – 80 rokov (> 80 %), respektíve vo veku 81 – 90 rokov (100 %). Nezistili žiadny významný rozdiel medzi mužmi a ženami, pokiaľ ide o prevalenciu tohto ochorenia, podobne ako v našej práci. Vo väčšine prác vyšla podstatne vyššia citlivosť PCR v porovnaní so štandardnými cytologickými farbiacimi technikami pri vyšetrovaní BAL, indukovaného aj neindukovaného spúta(18-22). Wakefield  et  al.(23) uvádzajú 90  % citlivosť PCR v porovnaní s 35 % citlivosťou klasického mikroskopického farbenia. Lipschik et al.(24) uvádzajú 93 % citlivosť a Chouaid et al.(22) dokonca až 100 % citlivosť a špecifickosť PCR v BAL a indukovanom spúte. Podobne ako vo väčšine prác sme zistili podstatne nižšiu citlivosť mikroskopie v porovnaní s PCR metódou. Mikroskopicky sme mali 66,3 % vzoriek falošne negatívnych a touto metódou sme zachytili v masívnej väčšine cystické štádiá a v jednom prípade intracystické telieska pneumocýst.
Vzhľadom na zvyšujúci sa počet imunosuprimovaných jedincov je diagnostika P. jirovecii nevyhnutná. Potvrdili sme to aj v našej štúdii, kde počet vyšetrení a detekcia tohto oportúnneho patogénu počas rokov stúpa a v 190 prípadoch sa nám podarilo odhaliť kauzálny agens zodpovedný za vážne pľúcne komplikácie u imunokompromitovaných pacientov.

Poďakovanie

Práca bola podporená projektom KEGA 013TTU-4/2019.

LITERATÚRA

1. Center for Diseases Control and Prevention. 2020. Pneumocystis pneumonia. [online]. Georgia (Atlanta): U.S. Department of Health & Human Services.

2. Truong, J., Ashurst, Jv. 2020. Pneumocystis (Carinii) jirovecii Pneu-monia. In StatPearls [online]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing.

3. Liu, Y., Su, L., Jiang, S. J., Qu, H. 2017. Risk factors for mortality from Pneumocystis carinii pneumonia (PCP) in non-HIV patients: A meta-analysis. In Oncotarget., roč. 8, č. 35, s. 59729-59739.

4. Kim, T-O., Lee, J-K., Kwon, Y-S., Kim, Y-I., Lim, S-Ch., Kim, M-S., Kho, B. G., Park, Ch-K., Oh, I-J., Kim, Y-Ch., Park, H. Y., Shin, H.J. 2021. Clinical characteristic and prognosis of patients with Pneumocystis jirovecii pneumonia without a compromised illness. In PLOS ONE., roč. 16, č. 2, s. 1-12.

5. Salzer, H. J. F., Chafer, G., Hoenigl, M., Gunther, G., Hoffmann, C., Kalsdorf, B., Alanio, A., Lange, C. 2018. Clinical, diagnostic, and treatment disparities between HIV-infected and non-HIV infected immunocompromised patients with Pneumocystis jirovecii pneumonia. In Respiration., roč. 96, č. 1, s. 1-14.

6. Bateman, M., Oladele, R., Kolls, J. K. 2020. Diagnosing Pneumocystis jirovecii pneumonia: A review of current methods and novel approaches. In Medical Mycology., roč. 58, č. 8, s. 1015-1028.

7. Tasaka, S. 2020. Recent advances in the diagnosis and management of Pneumocystis pneumonia. In Tuberculosis and Respiratory Diseases., roč. 83, č. 2, s. 132-140.

8. Giemsa, G. 1904. Eine vereinfachung und vervollkommnung mein-er methylenazur methylenblau-eosin-färbemethode zur erzielung der ro-manowsky-nacht’schen chromatin-färbung. In Zentralblatt für Bakteri-ologie, Parasitenkunde und Infektionskrankheiten der Tiere, I. Abteilung, originale., roč. 37, s. 308–311.

9. Garcia, L. S., Bruckner, D. A. 1997. Diagnostic Medical Parasitology. 3. vyd. Washington, D.C.: ASM Press, 1997, 937s. ISBN: 1-55581-116-7.

10. Tamburrini, E., Mencarini, P., Luca, A. D., Antinori, A., Visconti, E., Am-massari, A., Ortona, L., Ortona, E., Siracusano, A., Vicari, E. 1993. Simple and rapid two-step polymerase chain reaction for diagnosis of  P. carinii  pneumonia. In Journal of Clinical Microbiology., roč. 31, č. 10, s. 2788–2789.

11. Markechová, D., Tirpáková, A., Stehlíková, B. 2011. Základy štatistiky pre pedagógov. Nitra : FPV UKF v Nitre, 405s.

12. Albrecht, P., Horka, G. 1953. Pneumocystis pneumonia in western Slo-vakia. In Lekársky Obzor., č. 2, s. 766-73.

13. Boldiš, V., Ondriska, F., Kováč, Ľ., Nohýnková, E., Špitalská, E. 2013. Evidence of Pneumocystis jirovecii in human clinical samples in south-western Slovakia over a 10-year period (2001–2010). In Biologia., roč. 68, č. 4, s. 662-666.

14. Sing, A., Terebesius, K., Roggenkamp, A., Rüssmann, H., Tybus, K., Pfaff, F., Bogner, J. R., Emminger, Ch., Heesemann, J. 2000. Evaluation of diagnostic value and epidemiological implications of PCR for Pneumocystis carinii in different immunosuppressed and immunocompetent patient groups. In Journal of Clinical Microbiology., roč. 38, č. 4, s. 1461-1467.

15. Fillatre, P., Decaux, O., Jouneau, S., Revest, M., Gacouin, A., Rob-ert-Gangneux, F., Fresnel, A., Guiguen, C., Le Tulzo, Y., Jégo, P., Tattevin, P. 2014. Incidence of Pneumocystis jirovecii pneumonia among groups at risk in HIV-negative patients. In The American Journal of Medicine., roč. 127, č. 12, s. 1242.e11-1242.e17.

16. Gazaignes, S., Bergeron, A., Menotti, J., Desseaux, K., Molina, J. M., De Castro, N. 2020. Pneumocystis jirovecii and quantitative PCR: pneu-monia or colonization? In Revue des Maladies Respiratoires., roč. 37, č. 4, s. 299-307.

17. Abastabar, M., Mosayebi, E., Shokohi, T., Hedayati, M. T., Jarabi Amiri, M. R., Seifi, Z., Hadghani, I., Aliyali, M., Saber, S., Sheikholeslami, M. F. 2019. A multi-centered study of Pneumocystis jirovecii colonization in patients with respiratory disorders: Is there a colonization trend in the elderly? In Current Medical Mycology., roč. 5, č. 3, s. 19-25.

18. Galan, F., Oliver, J. L., Roux, P., Poirot, J. L., Bereziat, G. 1991. Detection of Pneumocystis carinii DNA by polymerase chain reaction compared to direct microscopy and immunofluorescence. In The Journal of protozoology., roč. 38, č. 6, s. 199S-200S.

19. Kitada, K., Oka, S., Kohjin, T., Kimura, S., Nakamura, Y, Shimada, K. 1993. Pneumocystis carinii pneumonia monitored by P. carinii shedding in sputum by the polymerase chain reaction. In Internal Medicine., roč. 32, č. 5, s. 370-373.

20. Leigh, T. R., Gazzard, B. G., Rowbotoom, A., Collins, J. V. 1993. Quantitative and qualitative comparison of DNA amplification by PCR with immunofluorescence staining for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. In Journal of Clinical Pathology., roč. 46, č. 2, s. 140-144.

21. Olsson, M., Elvin, K., Lofdahl, S., Linder, E. 1993. Detection of Pneumocystis carinii DNA in sputum and bronchoalveolar lavage samples by polymerase chain reaction. In Journal of Clinical Microbiology., roč. 31, č. 2, s. 221-226.

22. Chouaid, C., Roux, P., Lavard, I., Poirot, J. L., Housset, B. 1995. Use of the polymerase chain reaction technique on induced-sputum samples for the diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia in HIV-infected patients. A clinical and cost-analysis study. In American Journal of Clinical Pathology., roč. 104, č. 1, s. 72-75.

23. Wakefield, A. E., Pixley, F. J., Banerji, S., Sinclair, K., Miller, R. F., Moxon, E. R., Hopkin, J.M. 1990. Amplification of mitochondrial ribosomal RNA sequences from Pneumocystis carinii of rat and human origin. In Molecular and Biochemical Parasitology., roč. 43, č., s. 69-76.

24. Lipschik, G. Y., Andrawis, V. A., Ognibene, F. P., Kovacs, J. A., Gill, V. J., Nelson, N. A., Lundgren, J. D., Nielsen, J. O. 1992. Improved diagnosis of Pneumocystis carinii infection by polymerase chain reaction on induced sputum and blood. In THE LANCET., roč. 340, č. 8813, s. 203-206.