*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Lynchov syndróm je autozomálne dominantné dedičné ochorenie charakterizované defektmi v systéme opravy chybne spárovaných báz – MMR systéme (mismatch repair system). Ide o postreplikatívny opravný systém zaisťujúci integritu genómu prostredníctvom reparácie chybne inkorporovaných nukleotidov, tvorený predovšetkým štyrmi hlavnými génmi MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2. Je známe, že pacienti s diagnostikovaným Lynchovým syndrómom sú vystavení zvýšenému riziku rozvoja viacnásobných synchrónnych alebo metachrónnych kolonických a/alebo extrakolonických malignít so včasným nástupom fenotypu. U pacientov s Lynchovým syndrómom sa tieto typy malignít objavujú pomerne skoro, a to priemerne okolo 40. až 50. roku života (tabuľka 1). Medzi najčastejšie typy nádorov asociovaných s Lynchovým syndrómom patrí kolorektálny karcinóm, a to pri oboch pohlaviach, a karcinóm endometria u žien, ale aj rakovina žalúdka, ovárií, tenkého čreva, hepatobiliárneho a urinárneho traktu, mozgu a CNS a tiež široké spektrum ďalších onkologických ochorení(1).

Mikrosatelity a ich instabilita u pacientov s Lynchovým syndrómom

Mikrosatelity alebo aj krátke tandemové repetície (STR; short tandem repeats) sú vo všeobecnosti definované ako sekvenčné opakovania až do dĺžky 100 bázových párov(2). Sú tvorené opakujúcimi sa sekvenciami pozostávajúcimi z motívov veľkosti 1 – 6 nukleotidov, pričom pokrývajú zhruba 2,5 % ľudského genómu s počtom ~ 2,5 milióna lokusov(3). Sú označované za genetické hotspoty s mierou mutability 10- až 100 000× vyššou v porovnaní so zvyškom genómu(4). Udávaná frekvencia mutácií na generáciu je oproti jednonukleotidovým polymorfizmom rádovo vyššia(5). Predpokladá sa, že variácie dĺžky STR oblastí sú podmienené prekĺznutiu DNA v procese replikácie, čo v konečnom dôsledku vedie k indelom veľkosti jedného alebo viacerých mikrosatelitných motívov. Vzniknuté indely sú v oblastiach mikrosatelitných lokusov opravované najmä funkčným MMR systémom(6). Keďže mikrosatelity predstavujú veľmi nestabilné časti genómu, prítomnosť patologických zárodočných mutácií v MMR génoch a následná dysfunkcia MMR opravného systému u pacientov s Lynchovým syndrómom môžu vyústiť do mikrosatelitnej instability (MSI, microsatellite instability) (obrázok 1), pričom jej detekcia predstavuje v klinickej praxi dôležitý prognostický a diagnostický marker.

Aktuálne skríningové prístupy detekcie MSI v klinickej praxi

Detekcia MSI a skríning pacientov s Lynchovým syndrómom sú založené na dvoch základných prístupoch. Prvý, vychádzajúci z imunohistochémie (IHC; immunohistochemistry) proteínov zahrnutých v MMR systéme, a druhý, využívajúci PCR amplifikáciu vybraného počtu mikrosatelitových markerov (MSI-PCR) (tabuľka 2). Detekcia MSI predstavuje skríningový test, ktorý umožňuje z pomerne rozsiahlej vzorky nádorov vybrať tie, ktoré môžu byť asociované s Lynchovým syndrómom. Uvádza sa, že MSI vykazuje ~ 90 % Lynchových asociovaných nádorov v porovnaní s ~ 15 % sporadických kolorektálnych karcinómov, spôsobených najmä hypermetyláciou promótora génu MLH1(7). Vhodným markerom na selekciu sporadických nádorov je vyšetrenie na prítomnosť daných metylácií MLH1 alebo analýza mutácie p. V600E v géne BRAF(8).

Metóda MSI-PCR kombinuje fluorescenčnú multiplex PCR a kapilárovú elektroforézu, čím umožňuje detegovať status MSI porovnávaním fragmentačného profilu amplifikovaných markerov medzi zdravým a nádorovým tkanivom získaným od toho istého pacienta. V priebehu dekád boli predstavené viaceré panely, súčasné testy široko využívané v klinickej diagnostike sa však spoliehajú predovšetkým na lokusy tvorené mononukleotidovými opakovaniami – homopolymérmi. V súčasnosti najpoužívanejšou esejou založenou na tomto princípe je metóda fragmentačnej analýzy MSI Analysis System verzia 1.2 (Promega), ktorá využíva panel 5 kvázi-monomorfných homopolymérnych markerov BAT-25, BAT-26, NR- 21, NR-24 a MONO-27(9).

Na druhej strane IHC sa odporúča ako prvotné skríningové vyšetrenie pri liečbe pacientov, u ktorých existuje podozrenie na prítomnosť mutácií v MMR génoch, s cieľom identifikovať pacientov, ktorí sú vhodní na ďalšie molekulárnogenetické analýzy. IHC predstavuje rýchlu a relatívne jednoduchú esej, ktorá deteguje expresiu MMR proteínov MLH1, PMS2, MSH2 a MSH6 v tkanive odobratého z reprezentatívnej časti biopsie(10). Výraznejšou limitáciou IHC je nevyhnutná prítomnosť vysokokvalifikovaného personálu, a to pri odbere biopsie

aj pri vyhodnocovaní analýz. Bolo pozorované, že medzi výsledkami MSI a IHC analýzami existuje nesúlad, pričom uvádzaná citlivosť IHC pri predpovedaní MSI je ~ 92 %(11,12). Negatívami IHC sú takisto falošne pozitívne výsledky, ktoré vznikajú pri takých mutáciách v MMR génoch, ktoré vo výsledku neovplyvňujú transláciu, stabilitu a antigenicitu proteínu, čím dochádza k jeho intaktnému zafarbeniu(12). Porovnanie technických a metodologických aspektov MSI-PCR a IHC aj ich limitácie sumarizuje tabuľka 2.

MSI ako indikátor prognózy odpovede na imunoterapiu

Okrem iného detekcia MSI pomáha pri selekcii pacientov na zaradenie na imunoterapiu. Preukázalo sa, že pri metastatickom kolorektálnom karcinóme je ~ 10 % pacientov nesprávne zaradených do imunoterapeutických štúdií v dôsledku falošne pozitívnych výsledkov IHC alebo MSI-PCR(13). Na posúdenie adekvátnosti liečby pomocou inhibítorov imunitného kontrolného bodu (ICI; immune checkpoint inhibitors) sa odporúča kombinácia prístupu IHC a MSI-PCR pri metastatickom CRC aj pri iných druhoch nádorov spadajúcich do spektra Lynchovho syndrómu(14). Preukázalo sa, že nádory s vysokým stupňom MSI majú vo všeobecnosti vysokú pravdepodobnosť reakcie na inhibíciu PD-1/PD-L1 dráhy (programmed cell death 1/programed cell death ligand 1), ktorá je považovaná za jeden z kontrolných bodov imunitnej odpovede. Proteín PD-1, vysokoexprimovaný aktivovanými T-bunkami, B-bunkami, dendritickými bunkami a NK bunkami, ktorý po väzbe na PD-L1 receptor, nachádzajúci sa vo veľkom množstve na niektorých rakovinových bunkách, pomáha takýmto bunkám uniknúť pred imunitným systémom hostiteľa. Monoklonálne protilátky, akými sú inhibítory anti-PD-1 alebo anti-PD-L1 môžu takúto väzbu blokovať a zvyšovať tak imunitnú odpoveď proti bunkám nádoru (obrázok 2). Na základe predklinických štúdií je tento typ liečby účinný v kombi- nácii s rádioterapiou, chemoterapiou, inhibítormi kináz a epigenetickými liečivami(15).

Využitie masívne paralelného sekvenovania v MSI diagnostike

Aktuálne sa dostáva do popredia názor, že použitie panelového sekvenovania ako prvotného skríningu MSI predstavuje v klinickej praxi cenovo efektívny spôsob diagnostiky Lynchovho syndrómu a iných nádorových a polypóznych syndrómov(16), pričom sekvenovanie nádoru ako prvotný krok pri skríningu Lynchovho syndrómu môže nahradiť súčasne používané prístupy(17). Veľkou výhodou NGS metód oproti MSI- PCR je predovšetkým súbor analyzovaných markerov, ktorý varíruje až po niekoľko tisíc. Okrem vyššej citlivosti je to v niektorých prípadoch absencia párovej vzorky kontrolného nenádorového tkaniva, ktorá je pre prístupy MSI-PCR nevyhnutná. Dôkazy o adekvátnosti masívne paralelného sekvenovania pri detekcii MSI poskytlo sekvenovanie štandardne používaného génového panela Bethesda/NCI. Získané výsledky korelovali s metódou MSI-PCR analýzy, čo demonštruje, že prístupy založené na vysokoparalelnom sekvenovaní predstavujú vhodnú skríningovú a diagnostickú metódou na testovanie MSI(18). Detekcia MSI vychádzajúca z rozličných sekvenačných platforiem dosahuje vysokú špecificitu a senzitivitu, čo demonštruje, že tento prístup môže v blízkom čase plnohodnotne nahradiť konvenčne používané skríningové metódy(19). Vybrané štúdie zaoberajúce sa detekciou MSI v nádoroch kolorekta pomocou masívne paralelného sekvenovania zobrazuje tabuľka 3. Napriek širokému spektru nástrojov na vyhodnocovanie MSI zo sekvenčných dát vykazujúcich v porovnaní s MSI-PCR konkordanciu, ktorá varí- ruje od 92,3 % do 100 %(19-21), neboli doposiaľ predstavené konsenzuálne kritériá na vyhodnocovanie MSI, čo do istej miery limituje ich zavedenie do rutinnej klinickej praxe.

Potenciál cirkulujúcej nádorovej DNA v MSI diagnostike

Potenciál cirkulujúcej nádorovej DNA (ctDNA, circulating tumour DNA) je pripisovaný vlastnostiam, ako je schopnosť sledovať progresiu nádorového ochorenia, možnosť predpovedať recidívu nádoru a v neposlednom rade schopnosť odrážať stav nádorovej heterogenity(22). Zároveň medzi MSI fenotypom v ctDNA a nádorovom tkanive existuje vysoká miera korelácie. Keďže len malá časť z fragmentov ctDNA v cirkulácii pochádza z nádorových buniek, detekcia MSI založená na báze tekutej biopsie si vyžaduje veľmi citlivý prístup. Presnosť a citlivosť menej invazívnych metód založených na analýze voľných cirkulujúcich nukleových kyselín je ovplyvnená faktormi, medzi ktoré patria napríklad technické a bioinformatické výzvy pre efektívne sekvenovanie, mapovanie, volanie variantov a korekciu chýb v oblasti vysokorepetitívnych mikrosatelitných lokusov, nízka frakcia ctDNA v cirkulácii, respektíve chyby vznikajúce pri replikácii genómu(23). Prístupy na hodnotenie stavu MSI prostredníctvom analýzy ctDNA dosahujú konkordanciu na úrovni ~ 99 % pre status MSI medzi vzorkami tkaniva a ctDNA(12,24). Kritickým parametrom esejí vychádzajúcich z analýzy voľných cirkulujúcich nukleových kyselín je frakcia nádorových buniek, pretože účinnosť detekcie MSI vo vzorkách s vysokou kontamináciou zdravých buniek významne klesá(24). V neposlednom rade je to heterogenita a dynamika nádoru, pri ktorej intera intratumorová variabilita sú kľúčovým faktorom pri- spievajúcim k nesúladu medzi pacientmi/kohortami. Nádorové bunky prechádzajú v odpovedi na stres spôsobený prostredím a terapiou klonálnou evolúciou, ktorá môže meniť ich genetickú informáciu. Napriek tomu sa predpokladá, že tekutá biopsia má v porovnaní s tkanivom potenciál niekoľkonásobne lepšieho záchytu tumorovej heterogenity(23). Najnovšie validácie preukazujú 100 % senzitivitu a špecificitu, a to aj v prípade 0,05 % obsahu ctDNA(25). Napriek evidencii, že prístupy založené na analýze ctDNA poskytujú pri detekcii MSI pomocou vysokoparalelného sekvenovania mikrosatelitných lokusov dostatočnú citlivosť, sú pre ich zavedenie do klinickej praxe potrebné ďalšie funkčné validácie.

Záver

Široká dostupnosť detekcie MSI pomocou vysokoparalelného sekvenovania v klinickej praxi môže v konečnom dôsledku eliminovať spektrum komplikácií, ktoré sú spojené s aktuálne zaužívanými prístupmi. Zároveň, neustále inovácie vo výpočtových algoritmoch umožňujú rozsiahly skríning v desiatkach až stovkách vzoriek súčasne, so senzitivitou na úrovni konvenčne používaných skríningových nástrojov. Analýza telových tekutín okrem iného vedie ku kvalitnejšiemu manažmentu pacientovho ochorenia, a to pri monitorovaní odpovede tumoru na protinádorovú terapiu aj pri sledovaní jeho prípadnej recidívy.

Poďakovanie

Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt kód ITMS: 313011V578, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja, Táto práca bola podporená Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy č. APVV-18-0319 a projektom VEGA 1/0305/19

Konflikt záujmov

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadny konflikt záujmov.

LITERATÚRA

1. Tamura K, Kaneda M, Futagawa M, et al. Genetic and genomic basis of the mismatch repair system involved in Lynch syndrome. Int J Clin Oncol. 2019;24(9):999-1011.
2. Nadir E, Margalit H, Gallily T, Ben-Sasson SA. Microsatellite spreading in the human genome: evolutionary mechanisms and structural implications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1996;93(13):6470-6475.
3. Avvaru AK, Sharma D, Verma A, et MSDB: a comprehensive, annotated database of microsatellites. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D155-D159
4. Balzano E, Pelliccia F, Giunta S. Genome (in)stability at tandem reSeminars in Cell & Developmental Biology. Published online 2020.
5. Sun JX, Helgason A, Masson G, et al. A direct characterization of human mutation based on Nat Genet. 2012;44(10):1161- 1165.
6. Murat P, Guilbaud G, Sale DNA polymerase stalling at structured DNA constrains the expansion of short tandem repeats. Genome Biol. 2020;21(1):209.
7. Copija A, Waniczek D, Witkoś A, et Clinical Significance and Prognostic Relevance of Microsatellite Instability in Sporadic Colorectal Cancer Patients. Int J Mol Sci. 2017;18(1).
8. Hegde M, Ferber M, Mao R, et al. ACMG technical standards and guidelines for genetic testing for inherited colorectal cancer (Lynch syndrome, familial adenomatous polyposis, and MYH-associated polyposis). Genet Med. 2014;16(1):101-116.
9. Arulananda S, Thapa B, Walkiewicz M, et Mismatch Repair Protein Defects and Microsatellite Instability in Malignant Pleural Mesothelioma. J Thorac Oncol. 2018;13(10):1588-1594.
10. McCarthy AJ, Capo‐Chichi J, Spence T, et Heterogenous loss of mismatch repair (MMR) protein expression: a challenge for immunohistochemical interpretation and microsatellite instability (MSI) evaluation. The Journal of Pathology: Clinical Research. 2019;5(2):115-129.
11. Shia J. Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing for screening colorectal cancer patients at risk for hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: part The utility of immunohistochemistry. J Mol Diagn. 2008;10(4):293-300.
12. Zhang L. Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing for screening colorectal cancer patients at risk for hereditary nonpoly- posis colorectal cancer syndrome. Part II. The utility of microsatellite instability J Mol Diagn. 2008;10(4):301-307.
13. Cohen R, Hain E, Buhard O, et Association of Primary Resistance to Immune Checkpoint Inhibitors in Metastatic Colorectal Cancer With Misdiagnosis of Microsatellite Instability or Mismatch Repair Deficiency Status. JAMA Oncol. 2019;5(4):551-555.
14. Luchini C, Bibeau F, Ligtenberg MJL, et ESMO recommendations on microsatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and its relationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutational burden: a systematic review-based approach. Annals of Oncology. 2019;30(8):1232- 1243.
15. Galluzzi L, Buqué A, Kepp O, et Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 2015;28(6):690-714.
16. Gallego CJ, Shirts BH, Bennette CS, et Next-generation sequencing panels for the diagnosis of colorectal cancer and polyposis syndromes: a cost-effectiveness analysis. J Clin Oncol. 2015;33(18):2084.
17. Hampel H, Pearlman R, Beightol M, et Assessment of Tumor Sequencing as a Replacement for Lynch Syndrome Screening and Current Molecular Tests for Patients With Colorectal Cancer. JAMA Oncol. 2018;4(6):806-813.
18. Gan C, Love C, Beshay V, et Applicability of next generation sequencing technology in microsatellite instability testing. Genes . 2015;6(1):46- 59
19. Zhu L, Huang Y, Fang X, et A Novel and Reliable Method to Detect Microsatellite Instability in Colorectal Cancer by Next-Generation Sequencing. J Mol Diagn. 2018;20(2):225-231.
20. Niu B, Ye K, Zhang Q, et MSIsensor: microsatellite instability detection using paired tumor-normal sequence data. Bioinformatics. 2014;30(7):1015-1016.
21. Kautto EA, Bonneville R, Miya J, et Performance evaluation for rapid detection of pan-cancer microsatellite instability with MANTIS. Onco- target. 2017;8(5):7452-7463.
22. Myint NNM, Verma AM, Fernandez-Garcia D, et Circulating tumor DNA in patients with colorectal adenomas: assessment of detectability and genetic heterogeneity. Cell Death & Disease. 2018;9(9).
23. Wang L, Ajani Ushering in Liquid Biopsy for the Microsatellite Status: Advantages and Caveats. Clinical Cancer Research. 2019;25(23):6887- 6889.
24. Willis J, Lefterova MI, Artyomenko A, et al. Validation of Microsatellite Instability Detection Using a Comprehensive Plasma-Based Genotyping Clinical Cancer Research. 2019;25(23):7035-7045.
25. Han X, Zhang S, Zhou DC, et al. MSIsensor-ct: microsatellite instability detection using cfDNA sequencing data. Brief Bioinform. Published online 18 January
26. Lee Y, Lee JA, Park HE, et Targeted next-generation sequenc- ing-based detection of microsatellite instability in colorectal carcinomas. PLoS One. 2021;16(2):e0246356.
27. Kim JE, Chun S-M, Hong YS, et Mutation Burden and I Index for Detection of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer by Targeted Next-Generation Sequencing. J Mol Diagn. 2019;21(2):241-250.
28. Nowak JA, Yurgelun MB, Bruce JL, et Detection of Mismatch Repair Deficiency and Microsatellite Instability in Colorectal Adenocarcinoma by Targeted Next-Generation Sequencing. J Mol Diagn. 2017;19(1):84-91.
29. Hempelmann JA, Scroggins SM, Pritchard CC, Salipante MSIplus for Integrated Colorectal Cancer Molecular Testing by Next-Generation Sequencing. J Mol Diagn. 2015;17(6):705-714.