*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Koncept odoberania vzoriek vydychovaného vzduchu, známy tiež ako dychová biopsia (angl. breath biopsy), pre analýzu zmien spojených s patogenézou ochorení nie je úplne nový. Dávno pred súčasnou diagnostikou bol vydychovaný vzduch využívaný na rozpoznávanie niektorých chorôb. Napríklad sladký zápach dychu bol spájaný s diabetom mellitom, rybí zápach s ochorením pečene a zápach podobný moču s ochorením obličiek(1) . V súčasnosti je zavedených viacero dychových testov, ktoré sa bežne využívajú v praxi, napr. meranie vydychovaného oxidu dusnatého pri diagnostike a monitorovaní astmy(2) .

Nové technológie a tiež zvýšený dôraz na vysokovýkonnú biologickú analýzu a metabolomiku v súčasnej ére genomiky pomohli rozšíriť výskum v oblasti dychovej biopsie, a preto rýchlo rastie záujem o tzv. Breathomiku(3) . Vydychovaný ľudský vzduch obsahuje tisíce prchavých organických zlúčenín (angl. volatile organic compounds; VOC), ktoré majú potenciál ako biomarkery pre diagnostiku ochorení vrátane rakoviny(4,5) . O viacerých zavedených dychových testoch, ktoré využívajú analýzu endogénnych alebo exogénnych VOC, sa diskutuje v práci Pham and Beauchamp 2021(6) . Avšak vydychovaný vzduch obsahuje okrem volatilných zlúčenín respiračné kvapôčky pochádzajúce z pľúc a dýchacích ciest. Tieto mikroskopické častice aerosólu v sebe dokážu niesť nevolatilnú hmotu, ako sú elektrolyty, sacharidy, enzýmy, nukleové kyseliny, zvyšky dehydrovaných epitelových buniek a/alebo bielych krviniek (7) a tiež rôzne infekčné agensy (napr. baktérie, huby a vírusy)(8) . Napriek tomu, že vydychovaný vzduch je v podstate odpadovým produktom, predstavuje bohatý zdroj pre neinvazívne získavanie a analýzu biomarkerov využiteľných vo výskume a v potenciálnych biomedicínskych aplikáciách.

Metódy získavania a analýzy DNA z vydychovaného vzduchu

Jedným z prístupov na získanie genetického materiálu z dychovej biopsie je kondenzácia vydychovaného vzduchu (angl. exhaled breath condensate; EBC). V štúdiách boli na zber tohto typu vzorky opísané rôzne customizované aj komerčne dostupné systémy, ako sú RTube, EcoScreen, TURBO-DECCS alebo Anacon(9) . Princíp odberu EBC prebieha tak, že teplý vzduch vydychovaný z pľúc začne kondenzovať, keď príde do kontaktu s chladiacim médiom, respektíve kondenzačným systémom prístroja. Vydychovaný vzduch sa po kondenzácii mení na kvapalinu zachytávanú v systéme. Na chladenie sa môžu použiť rôzne médiá, ako je napríklad ľad, suchý ľad, tekutý dusík alebo elektrické chladiace systémy a iné. Pri teplotách pod 4 °C dochádza ku kondenzácii vydychovaného vzduchu, avšak samotná teplota kondenzácie môže ovplyvniť koncentráciu biomarkerov v EBC. Čas potrebný na odber vzoriek je priamoúmerný získanému objemu EBC, pričom podľa dostupnej literatúry možno získať za 10 – 30 minút približne 1-3 ml vzorky. S prihliadnutím na individuálnu variabilitu sa však môže výsledný objem EBC pre každého jedinca líšiť(10) . Množstvo DNA extrahovanej z EBC je pomerne nízke a nie vždy spĺňa kvantitu požadovanú pre daný typ analýzy(11) , no v literatúre bola opísaná priemerná koncentrácia extrahovanej DNA v 100 μl eluátu približne 20 ng/μl(12)(12) .

Aplikácie DNA extrahovanej z ovzdušia a biopsie dychu

Vzduch obsahuje rôzne častice (napr. spóry, peľ, prach, baktérie, vírusy, respiračné kvapôčky), ktoré môžu zotrvať v atmosfére aj niekoľko dní. V závislosti od podmienok prostredia (napr. vlhkosti vzduchu) a veľkosti častíc môžu byť potom transportované na pomerne veľké vzdialenosti(13) . Aj preto sa molekuly DNA uvoľňujú do okolitého ovzdušia v podobe tzv. environmentálnej DNA (eDNA), ktorá v súčasnosti predstavuje jeden z najrýchlejšie sa rozvíjajúcich prístupov pre monitorovanie biodiverzity(14) . Fakt, že respiračné kvapôčky môžu obsahovať vírusy, je okrem iného dobrým predpokladom na monitorovanie prítomnosti patogénov(15) . Analýza eDNA na exponovaných stanovištiach s vysokou hustotou osôb by teda mohla predstavovať prístup na monitorovanie vírusov, ktoré sa šíria kvapôčkovou infekciou, ako je napríklad vírus SARS-CoV-2 v čase pandémie ochorenia COVID-19.

Na druhej strane analýza nukleových kyselín priamo z vydychovaného vzduchu má väčší potenciál pre biomedicínske aplikácie. Môže taktiež poslúžiť na identifikáciu patogénov respiračného traktu, no vydychovaný vzduch poskytuje aj neinvazívny prístup ku genetickému materiálu epitelovej výstelky pľúc(9) . Biopsia dychu sa preto javí ako vhodná alternatíva pre štúdium genetických zmien spojených s malignitami dýchacieho traktu, ako je napríklad rakovina pľúc(16) . Štandardné prístupy ako bronchoskopia a biopsia ihlou majú súvisiace riziká, a preto nie sú vhodné pre populačný skríning, ktorý by umožnil včasnú diagnostiku tohto ochorenia. Diagnostika nádoru v pokročilých štádiách však výrazne zhoršuje prežívanie pacientov, a preto sú žiaduce nové, neinvazívne diagnostické nástroje na skríning a včasnú diagnostiku rakoviny pľúc(17) . Ako vhodný a ľahko dostupný orgánovošpecifický zdroj biologických informácií sa javí dychová biopsia, pretože umožnila identifikáciu genetických zmien spojených s karcinogenézou tohto ochorenia v EBC pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc(12) .

Pacienti v pokročilom štádiu rakoviny pľúc nie sú vždy schopní absolvovať opakovanú biopsiu na ďalšiu molekulárnu analýzu, preto sa aktívne vyvíjajú neinvazívne metódy na báze cell-free DNA (cfDNA). V tejto spojitosti Smyth a kol. študovali možnosť detekcie mutácie EGFR T790M na vzorkách EGFR-pozitívnych pacientov s adenokarcinómom pľúc vo IV. štádiu. Výsledky naznačujú, že EBC sú pre zachytenie cfDNA s mutáciou EGFR dokonca vhodnejším typom vzorky ako krvná plazma. Nedokonalá citlivosť plazmy je pravdepodobne spôsobená vysokými hladinami wild-type genómovej DNA, ktorá maskuje menej zastúpenú mutantnú alelu a príčinou je tiež vysoká nukleázová aktivita v krvi. EBC je acelulárna tekutina, a preto môže obsahovať nižšie hladiny wild-type DNA, pričom aj hladina endogénnej nukleázy v pľúcach je v porovnaní s krvou oveľa nižšia(18) . Nízky výťažok DNA z EBC komplikuje podrobnejšiu analýzu mutácií konvenčnými metódami, v dôsledku čoho je tento prístup relatívne slabo preskúmaný. Pozornosť je potrebné venovať optimalizácii odberu, uskladneniu a spracovaniu vzoriek EBC aj aplikácii citlivejších metód na analýzu genetického materiálu, ako je masívne paralelné sekvenovanie. Výsledky štúdie, ktorá skúmala túto problematiku, naznačujú, že DNA z vydychovaného vzduchu zdravých jedincov má potenciál na odhalenie mutácií, ktoré by mohli reprezentovať veľmi skoré neoplastické zmeny(16) . Analýza nukleových kyselín z EBC by teda mohla predstavovať sľubný prístup pre skríning a včasnú diagnostiku rakoviny pľúc, no keďže je to orgánovošpecifická biotekutina, môže mať potenciál aj pri vyšetrovaní metastatických ochorení v oblasti hrudníka(18) .

Záver

Na rozdiel od konvenčných skríningových prístupov vychádzajúcich predovšetkým z tkanivovej a tekutej biopsie, ktorých proces získavania predstavuje pre pacienta viac alebo menej stresujúci zákrok, je proces získavania dychovej biopsie z pohľadu diagnostickej aplikácie maximálne neinvazívnou stratégiou. Vydychovaný aerosól je rezervoárom klinicky relevantných genomických informácií, akými sú nukleové kyseliny, ale tiež proteínov, signálnych molekúl či rôznych vírusových a patogénnych agensov. Množstvo biomarkerov derivovaných z dychovej biopsie sa do pľúc a následne do aerosólu dostáva prostredníctvom systematickej cirkulácie a difúzie priamo z krvi. Výskumy prebiehajúce v tejto oblasti naznačujú, že pomocou dychovej biopsie možno detegovať a následne monitorovať aj ochorenia vzdialených orgánových sústav, ako je centrálna nervová sústava, respektíve gastrointestinálny trakt. Z dychu extrahované substancie môžu slúžiť pri skorej detekcii ochorenia v expandujúcej oblasti precíznej a personalizovanej biomedicíny. Vznikajúce skríningové testy na báze dychovej biopsie môžu práve vďaka svojej jednoduchej implementácii nájsť uplatnenie aj v centrách primárnej starostlivosti. Majú veľký potenciál stať sa vhodným nástrojom populačných skríningových programov a dramaticky zlepšiť včasnú detekciu závažných patológií, a tým aj prežívanie pacientov s mnohými typmi onkologických a vírusových ochorení.

Poďakovanie
Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekty: Integratívna stratégia v rozvoji personalizovanej medicíny vybraných zhubných nádorových ochorení a jej vplyv na kvalitu života, kód ITMS: 313011V446 a Pangenomika pre personalizovaný klinický manažment infikovaných osôb na základe identifikovaného virálneho genómu a ľudského exómu, kód ITMS: 313011ATL7, spolufinancované zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

LITERATÚRA

1. Lawal O, Ahmed WM, Nijsen TME, et al. Exhaled breath analysis: a review of “breath-taking” methods for off-line analysis. Metabolomics. 2017; 13: 110.
2. Grob NM, Dweik RA. Exhaled nitric oxide in asthma: progress since the introduction of standardized methodology. J Breath Res. 2008; 2: 37002.
3. Kuo TC, Tan CE, Wang SY, et al. Human Breathomics Database. Database (Oxford). 2020; 2020: baz139. doi: 10.1093/database/baz139.
4. Wu X, Zhu L, Ma PC. Next-Generation Novel Noninvasive Cancer Molecular Diagnostics Platforms Beyond Tissues. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2018; 38: 964-977.
5. Krilaviciute A, Heiss JA, Leja M, et al. Detection of cancer through exhaled breath: a systematic review. Oncotarget. 2015; 6: 38643-38657.
6. Pham YL, Beauchamp J. Breath Biomarkers in Diagnostic Applications. Molecules. 2021; 26. doi: 10.3390/molecules26185514.
7. Stadnytskyi V, Bax CE, Bax A, et al. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020; 117: 11875-11877.
8. Atkinson J, Chartier Y, Pessoa-Silva CL, et al. Natural Ventilation for Infection Control in Health-Care Settings. Geneva: World Health Organization; 2013.
9. Koc A, Goksel T, Pelit L, et al. cfDNA in exhaled breath condensate (EBC) and contamination by ambient air: toward volatile biopsies. J Breath Res. 2019; 13: 036006.
10. Youssef O, Sarhadi VK, Armengol G, et al. Exhaled breath condensate as a source of biomarkers for lung carcinomas. A focus on genetic and epigenetic markers-A mini-review. Genes Chromosomes Cancer. 2016; 55: 905-914.
11. Chen JL, Chen JR, Huang FF, et al. Analysis of p16 gene mutations and their expression using exhaled breath condensate in non-small-cell lung cancer. Oncol Lett. 2015; 10: 1477-1480.
12. Carpagnano GE, Foschino-Barbaro MP, Mulé G, et al. 3p microsatellite alterations in exhaled breath condensate from patients with non-small cell lung cancer. Am J Respir Crit Care Med. 2005; 172: 738-744.
13. Lynggaard C, Bertelsen MF, Jensen CV, et al. Airborne environmental DNA for terrestrial vertebrate community monitoring. Curr Biol. 2022; 32: 701-707.e5.
14. Clare EL, Economou CK, Faulkes CG, et al. eDNAir: proof of concept that animal DNA can be collected from air sampling. PeerJ. 2021; 9: e11030.
15. Hirota K. Air contamination with SARS-CoV-2 in the operating room. J Anesth. 2021; 35: 333-336.
16. Youssef O, Knuuttila A, Piirilä P, et al. Presence of cancer-associated mutations in exhaled breath condensates of healthy individuals by next generation sequencing. Oncotarget. 2017; 8: 18166-18176.
17. Dent AG, Sutedja TG, Zimmerman PV. Exhaled breath analysis for lung cancer. J Thorac Dis. 2013; 5 Suppl 5: S540-S550.
18. Smyth RJ, Toomey SM, Sartori A, et al. Brief Report on the Detection of the EGFR T790M Mutation in Exhaled Breath Condensate from Lung Cancer Patients. J Thorac Oncol. 2018; 13: 1213-1216.